Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması
Summary
Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.
Abstract
RNA susturma ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş, diziye özgü gen düzenleme mekanizmasıdır. Çeşitli bitki patojenleri konak bitki RNA susturma yolu inhibe yeteneği ile proteinler gelişti. Virüs efektörü proteinlerinin aksine, sadece birkaç salgılanan efektör proteinbakteriyel, oomisel ve mantar patojenlerinde RNA susturma yeteneğini göstermiştir ve çoğu efektörmoleküler fonksiyonları büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, rna susturma gözlemlemek ve bitki patojenleri tarafından salgılanan efektör proteinleri karakterize etmek için genel bir yöntem olarak hizmet verebilecek ortak infiltrasyon tsay’ın biraz değiştirilmiş bir versiyonunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Yaklaşımın temel adımları sağlıklı ve tam olarak gelişmiş yaprakları seçmek, bakteri kültürünü 600 nm’de uygun optik yoğunluğa (OD) ayarlamak ve sızmış olan da optimum zamanda yeşil floresan proteini (GFP) floresanını gözlemlemektir. zayıf bastırma aktivitesi ile etkileri atlayarak önlemek için bırakır. Bu geliştirilmiş protokol, RNA susturucu baskılayıcıların hızlı, doğru ve kapsamlı taranmasına katkıda bulunacak ve bu proteinlerin moleküler işlevlerini araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet verecektir.
Introduction
Son yirmi yılda, bitki hastalıklarına neden olan mikroorganizmaların genom dizilimindeki ivme, dizi bilgileri ile kodlanmış proteinlerin biyolojik işlevleri arasında giderek artan bir bilgi boşluğuna yol açmıştır1. Sıralama projelerinin ortaya çıkardığı moleküller arasında doğuştan gelen bağışıklığı baskılayan ve konak kolonizasyonunu kolaylaştıran efektör moleküller; bu faktörler bakteriler, nematodlar ve ipliksi mikroplar da dahil olmak üzere yıkıcı bitki patojenleri tarafından salgılanır. Bu tehditlere yanıt vermek için, konak bitkiler bu efektörleri tanıyan yeni reseptörler gelişti, bağışıklık yanıtının restorasyonu sağlayan. Bu nedenle, efektörler çeşitli seçici baskılara tabidir, patojen soyları arasında efektör repertoireçeşitlenmesine yol açan2. Son yıllarda, bitki patojenleri putatif etkileri sinyal yollarının disregülasyonu da dahil olmak üzere çeşitli şekillerde mikroplar yararına konak hücresel süreçleri engelleyerek bitki doğuştan bağışıklık bozmak için gösterilmiştir, transkripsiyon, hücre içi ulaşım, sitoiskelet istikrar, vezikül ticareti, vezikül ticareti, ve RNA silele3,4,5. Ancak, patojen efektörlerin büyük çoğunluğu, özellikle filamentöz patojenler olanlar, esrarengiz kalmıştır.
RNA susturma ökaryotlar arasında korunan homoloji aracılı gen inaktivasyon makinalarıdır. Süreç uzun çift telli RNA (dsRNA) tarafından tetiklenir ve homolog tek iplikçikli RNA (ssRNA) bir dizi özgü bir şekilde hedefler ve antiviralsavunma6 dahil biyolojik süreçlerin geniş bir yelpazede manipüle. Konakçının doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini aşmak için, bazı virüsler RNA’nın susturulmasını dengelemek için evrimleşmiştir, hücre içi bölmelerde çoğalma veya susturma yeniden organize edilmiş sinyalden kaçma yeteneği de dahil olmak üzere. Bununla birlikte, virüslerin genomlarını RNA susturma bağımlı gen fonksiyonu kaybına karşı korumaları en genel strateji, RNA’yı susturan spesifik proteinleri kodlamaktır7,8. Çeşitli mekanistik farklı yaklaşımlar ekran ve RNA susturucu viral bastırıcılar karakterize kurulmuştur (VSR), Agrobacterium tumefaciens kültürlerin co-infiltrasyon dahil, putatif bastırıcılar ifade transgenik bitkiler, aşılama ve hücre kültürü9,10,11,12,13.
Bu tahlillerin her biri avantajları ve dezavantajları vardır ve VsR’ları kendi farklı bir şekilde tanımlar. En yaygın yaklaşımlardan biri, Nicotiana benthamiana 16c bitkileri üzerinde potansiyel viral protein ve muhabir gen (genellikle yeşil floresan protein [GFP]) barındıran bireysel A. tmuefaciens kültürlerin eş-infiltrasyon dayanmaktadır eş selabahar mozaik virüs 35S organizatörü kontrolü altında GFP ifade. Aktif bir viral susturucu baskılayıcı yokluğunda, GFP konak hücreleri tarafından eksojen olarak tanımlanır ve 3 gün post-infiltrasyon (dpi) içinde susturulur. Buna karşılık, viral protein bastırma aktivitesi varsa, GFP ifade düzeyi 3−9 dpi9ötesinde sabit kalır. Bu ortak infiltrasyon tsay basit ve hızlı; ancak, ne son derece kararlı ne de hassas. Yine de, titreyen birçok RNA virüsleri çeşitli protein dizileri ve yapıları ile çok sayıda VSR tespit etmiştir7,8.
Son zamanlarda, hücresel RNA susturma aktivitesiinin inhibe edebilirsiniz çeşitli efektör proteinler bakteriyel karakterize edilmiştir, oomisin, ve mantar bitkisi patojenler14,15,16. Bu bulgular, RNA susturma bastırma çoğu krallıkta patojenler tarafından kullanılan enfeksiyonu kolaylaştırmak için ortak bir strateji olduğunu ima eder. Teoride, birçok, hepsi değilse de, efektörlerr rna susturucular (RSSs) kodlamak olabilir; ancak bugüne kadar, özellikle güvenilir ve genel tarama stratejisinin yetersizliği nedeniyle sadece birkaç ı tespit edilmiştir. Ayrıca, Bitki patojenlerinin büyük çoğunluğunda RNA susturucuları araştırılmamıştır17.
Bu raporda, tarımsal infiltrasyon testini kullanarak lokal ve sistemik RNA susturmalarını bastırabilen bitki patojen efektörlerini belirlemek için optimize edilmiş ve genel bir protokol sunacağız. Bu çalışmanın en önemli amacı protokolün temel yönlerini vurgulamak ve adımları ayrıntılı olarak açıklamak, böylece bitki patojenlerinin hemen hemen tüm etkileri için uygun bir tarama testsağlamaktı.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA susturma viral, bakteriyel, oomycete ve mantar patojenleri ile mücadele için bitkiler tarafından kullanılan önemli bir savunma mekanizmasıdır. Buna karşılık, bu mikroplar antiviral susturma karşı susturucu proteinleri susturma evrimleşmiş, ve bu RSSs RNA susturma yolu farklı adımları ile müdahale22,23. RSSS10’utanımlamak için çeşitli tarama denemeleri geliştirilmiştir.
Burada, P. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Şangay Eğitim Geliştirme Vakfı ve Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı “Shuguang Programı” hibe tarafından desteklenmiştir ( 2018YFD0201500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 31571696 ve 31660510), Çin Genç Profesyoneller için Bin Yetenek Programı ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
