स्थानिक तराजू में असुरक्षित मीडिया में माइक्रोबियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री के साथ द्रव उपकरणों का संयोजन
Summary
सफलता घटता (BTCs) असुरक्षित मीडिया में बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन करने के लिए कुशल उपकरण हैं । यहां हम बीटीसी प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्रिक काउंटिंग के साथ संयोजन में तरल उपकरणों के आधार पर उपकरण पेश करते हैं।
Abstract
असुरक्षित मीडिया में सूक्ष्मजीवों के परिवहन, फैलाव और जमाव को समझना एक जटिल वैज्ञानिक कार्य है जिसमें हाइड्रोडायनामिक्स, पारिस्थितिकी और पर्यावरण इंजीनियरिंग के रूप में विविध विषय शामिल हैं । विभिन्न स्थानिक तराजू पर असुरक्षित वातावरण में जीवाणु परिवहन मॉडलिंग बेहतर बैक्टीरियल परिवहन के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है, अभी तक वर्तमान मॉडल अक्सर प्रयोगशाला से क्षेत्र की स्थिति के लिए बड़े पैमाने पर करने के लिए असफल । यहां, हम दो स्थानिक तराजू पर असुरक्षित मीडिया में जीवाणु परिवहन का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक उपकरण पेश करते हैं । इन उपकरणों का उद्देश्य पारदर्शी छिद्रपूर्ण मैट्रिस में इंजेक्ट किए गए बैक्टीरिया के स्थूल अवलोकन (जैसे सफलता घटता या जमाव प्रोफाइल) प्राप्त करना है। छोटे पैमाने पर (10-1000 माइक्रोन) पर, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को ऑप्टिकल वीडियो-माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के साथ जोड़ा जाता है ताकि सफलता घटता प्राप्त किया जा सके और साथ ही, ताकना पैमाने पर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं को ट्रैक किया जा सके। बड़े पैमाने पर, प्रवाह साइटोमेट्री को सफलता घटता प्राप्त करने के लिए एक स्वयं निर्मित रोबोट डिस्पेंसर के साथ जोड़ा जाता है। हम इन उपकरणों की उपयोगिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए वर्णन करते हैं कि कैसे बैक्टीरिया को जटिल असुरक्षित मीडिया में ले जाया जाता है जैसे कि धाराओं के हाइपोहेइक क्षेत्र। चूंकि ये उपकरण तराजू में एक साथ माप प्रदान करते हैं, इसलिए वे तंत्र आधारित मॉडलों के लिए मार्ग प्रशस्त करते हैं, जो अपस्केलिंग के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इन उपकरणों के आवेदन से न केवल उपन्यास बायोरेमेडिएशन अनुप्रयोगों के विकास में योगदान हो सकता है बल्कि असुरक्षित सब्सट्रेट्स को उपनिवेश बनाने वाले सूक्ष्मजीवों की पारिस्थितिक रणनीतियों पर नई रोशनी भी आ सकती है।
Introduction
असुरक्षित मीडिया के माध्यम से रोगाणुओं के परिवहन को समझने के उद्देश्य से किए गए अध्ययन मुख्य रूप से संदूषण1, रोग2 और बायोरेमेडिएशन3के संचरण की चिंताओं से प्रेरित हैं । इस संबंध में, बैक्टीरिया को ज्यादातर परिवहन मॉडल4 में कणों के रूप में माना गया है और बायोफिल्म्स से छानने, तनाव, गुरुत्वाकर्षण निपटान या पुनर्मोबिलीकरण जैसी प्रक्रियाओं को रोगाणुओं के प्रतिधारण या परिवहन के ड्राइवरों के रूप में पहचाना गया है5। हालांकि, असुरक्षित परिदृश्य के माध्यम से बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन भी हमें इन जटिल वातावरण में उनकी सफलता को रेखांकित पारिस्थितिक रणनीतियों पर सूचित कर सकते हैं । फिर भी, इसके लिए एकल कोशिका, जनसंख्या या माइक्रोबियल समुदाय स्तर पर काम करने वाले उपन्यास प्रयोगों और गणितीय मॉडलों की आवश्यकता होती है।
प्राकृतिक छिद्रपूर्ण वातावरण, जैसे कि धाराओं और नदियों के हाइपोहिक क्षेत्र में पाए जाते हैं, बायोफिल्म बनाने वाले रोगाणुओं के विविध समुदायों द्वारा घनी उपनिवेश हैं6। बायोफिल्म्स ऐसी संरचनाएं बनाती हैं जो प्रवाह को संशोधित करती हैं और इस प्रकार तरल चरण7,8में बैक्टीरिया का परिवहन और फैलाव होती है । ताकना पैमाने पर बैक्टीरिया का परिवहन असुरक्षित मैट्रिक्स में विवश अंतरिक्ष उपलब्धता पर निर्भर करता है और गतिशीलता से संबंधित फैलाव कम घनी आबादी वाले क्षेत्रों में संसाधनों के लिए कम प्रतिस्पर्धा के माध्यम से व्यक्तिगत फिटनेस को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका हो सकता है। दूसरी ओर, मोटिवल बैक्टीरिया असुरक्षित मैट्रिक्स के अधिक अलग-अलग क्षेत्रों तक भी पहुंच सकते हैं और ऐसे क्षेत्रों की विस्तारित खोज10 आबादीको पारिस्थितिक अवसर प्रदान कर सकती है। बड़े स्थानिक तराजू पर, बायोफिल्म विकास प्रवाह पथों को भी बदल देता है जिससे छिद्रों का (आंशिक) अवरुद्ध होता है और इस प्रकार, और भी अधिक चैनलाइज्ड और विषम प्रवाह की स्थिति11की स्थापना के लिए। यह पोषक तत्वों की आपूर्ति और फैलाव क्षमता, आवृत्ति और दूरी के लिए परिणाम है । उदाहरण के लिए, तरजीही प्रवाह तथाकथित “फास्ट-ट्रैक” उत्पन्न कर सकता है और मोटिव बैक्टीरिया इन पटरियों12के साथ स्थानीय प्रवाह की तुलना में और भी अधिक वेग प्राप्त कर सकता है। यह उपन्यास आवासों की खोज को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका है।
असुरक्षित मीडिया में मोती और गैर-मोती बैक्टीरिया (और कणों) के परिवहन के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरण खुद को लाभ उठाते हैं। संख्यात्मक मॉडल में अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण महान भविष्य कहनेवाला क्षमताएं होती हैं, हालांकि अक्सर अंतर्निहित मान्यताओं द्वारा सीमित होती हैं4। प्रयोगशाला-पैमाने पर प्रयोग13,14 सफलता वक्र (बीटीसी) मॉडलिंग के साथ संयुक्त रूप से चिपके हुए दक्षता15के लिए बैक्टीरियल सेल सतह गुणों के महत्व में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है । आमतौर पर, BTCs (यानी, एक निश्चित स्थान पर कण एकाग्रता की समय श्रृंखला) लगातार दर विज्ञप्ति और प्रयोगात्मक डिवाइस के बहिर्वाह पर सेल संख्या के माप के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । इस संदर्भ में, BTCs असुरक्षित मैट्रिक्स में बैक्टीरिया के advection-फैलाव गतिशीलता को प्रतिबिंबित और लगाव के लिए एक सिंक शब्द लेखांकन द्वारा बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, अकेले बीटीसी के मॉडलिंग परिवहन प्रक्रियाओं के लिए असुरक्षित सब्सट्रेट या बायोफिल्म के स्थानिक संगठन की भूमिका को हल नहीं करता है। फैलाव या बयान प्रोफाइल जैसे अन्य स्थूल नमूदार अवलोकन स्थानिक वितरण या बनाए गए कणों या बढ़ते समुदायों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए सिद्ध किए गए हैं । माइक्रोफ्लुइडिक्स एक ऐसी तकनीक है जो माइक्रोस्कोपी जांच,9,12, 16द्वारा असुरक्षित मीडिया में परिवहन का अध्ययन करने की अनुमति देती है, और हाल के काम को छोड़कर,10,प्रयोगात्मक प्रणालियां आम तौर पर संकल्प के एक लंबाई पैमाने पर बाधित होती हैं, यानी, पोर स्केल या पूरे तरल उपकरण पैमाने।16
यहां, हम विभिन्न तराजू पर असुरक्षित परिदृश्य में मोती और गैर-मोती बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन करने के लिए संयुक्त तरीकों का एक सूट पेश करते हैं। हम बीटीसी विश्लेषण के माध्यम से बड़े पैमाने पर जानकारी के साथ ताकना पैमाने पर जीवाणु परिवहन की टिप्पणियों को जोड़ते हैं। पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके नरम लिथोग्राफी से निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण जैव-संगत हैं, रसायनों की एक श्रृंखला के लिए प्रतिरोधी हैं, कम लागत पर प्रतिकूलता की अनुमति देते हैं और सूक्ष्म अवलोकन के लिए उत्कृष्ट ऑप्टिकल पारदर्शिता के साथ-साथ कम ऑटोफ्लोरेसेंस महत्वपूर्ण प्रदान करते हैं। पीडीएमएस पर आधारित माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग पहले सरल चैनलों17 या अधिक जटिल ज्यामिति12में रोगाणुओं के परिवहन का अध्ययन करने के लिए किया जाता रहा है। हालांकि, आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग अल्पकालिक क्षितिज और जीवित कोशिकाओं के एपीआई-फ्लोरेसेंस सूक्ष्म अवलोकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, आमतौर पर आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों (जैसे, जीएफपी-टैग किए गए उपभेदों) तक सीमित है। यहां हम प्रवाह साइटोमेट्री के संयोजन में पॉली (मिथाइल मेथाक्रिलेट) (पीएमएमए, जिसे प्लेक्सीग्लास के रूप में भी जाना जाता है) से निर्मित माइक्रोस्कोपी और बड़े उपकरणों के संयोजन में पीडीएमएस आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके बैक्टीरियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए उपकरण पेश करते हैं। पीडीएमएस और पीएमएमए गैस पारमेबिलिटी और सतह गुणों में भिन्न होते हैं, इस प्रकार बैक्टीरियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए पूरक अवसर प्रदान करते हैं। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस अधिक नियंत्रित वातावरण प्रदान करता है, बड़ा डिवाइस समय की विस्तारित अवधि में प्रयोगों के लिए या प्राकृतिक जीवाणु समुदायों का उपयोग करने की अनुमति देता है । एक समर्पित क्षेत्र में उच्च लौकिक संकल्प पर माइक्रोस्कोपी गिनती पीडीएमएस आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीटीसी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पीएमएमए-आधारित डिवाइस से बीटीसी मॉडलिंग के लिए सेल काउंट प्राप्त करने के लिए, हम प्रवाह साइटोमेट्री के संयोजन में एक स्व-निर्मित स्वचालित तरल मशीन पेश करते हैं। इस सेटअप में, कोशिकाएं तरल उपकरण से गुजरती हैं और लगातार 96 अच्छी प्लेटों में तिरस्कृत होती हैं। लौकिक संकल्प न्यूनतम मात्रा है कि सही तिरस्कृत किया जा सकता है और इस तरह तरल उपकरण के माध्यम से मध्यम प्रवाह दर द्वारा प्रतिबंधित है । कुओं में फिक्सेटिव विकास को रोकता है और डाउनस्ट्रीम फ्लो-साइटोमेट्रिक गणना के लिए डीएनए धुंधला होने की सुविधा प्रदान करता है । परिवहन प्रयोगों के दौरान बैक्टीरियल विकास को रोकने के लिए हम एक न्यूनतम माध्यम (जिसे मोटिविटी बफर कहा जाता है) का उपयोग करते हैं।
चूंकि विभिन्न पैमानों पर तरल उपकरणों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं, इसलिए हम केवल संक्षेप में ऐसे उपकरणों का उत्पादन करने और बीटीसी रिकॉर्ड करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित करने की तकनीकों को पेश करते हैं। इसी प्रकार, रोगाणुओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक गणना के लिए विभिन्न दिनचर्या मौजूद है और उपयोगकर्ताओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता होती है। हम फ्लोरोसेंटली-टैग की गई कोशिकाओं के बीटीसी को रिकॉर्ड करने के लिए सूक्ष्म इमेजिंग के साथ संयोजन में माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपन्यास उपयोग की रिपोर्ट करते हैं। ताकना पैमाने पर, स्थानीय वेग और प्रक्षेप पथ छवि प्रसंस्करण के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं। इसके अलावा, हम एक देशी धारा बायोफिल्म द्वारा उपनिवेश छिद्रण वातावरण में मोती और गैर-मोती कोशिकाओं के जीवाणु परिवहन का निरीक्षण करने के लिए प्रवाह-साइटोमेट्रिक गिनती के साथ संयोजन में पीएमएमए-आधारित तरल उपकरण के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एकल सेल और जनसंख्या स्तर पर असुरक्षित प्रणालियों के माध्यम से रोगाणुओं के परिवहन का अध्ययन करने के लिए दो साधन सुझाते हैं । जबकि बीटीसी मॉडलिंग का उपयोग कर परिवहन घटनाओं के अध्ययन पारिस्थितिक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रोबोट मशीन और dispenser.py स्क्रिप्ट के सेटअप के साथ एंटोनी Wiedmer की मदद स्वीकार करते हैं ।
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
