将流体设备与显微镜和流式细胞学相结合，研究跨空间尺度的多孔介质中的微生物传输

Summary

突破性曲线 （BTC） 是研究多孔介质中细菌运输的高效工具。在这里，我们介绍基于流体器件的工具，结合显微镜和流动细胞测量计数，以获得BTC。

Abstract

了解多孔介质中微生物的传输、分散和沉积是一项复杂的科学任务，包括流体动力学、生态学和环境工程等不同主题。在不同空间尺度的多孔环境中对细菌运输进行建模对于更好地预测细菌运输的后果至关重要，但当前的模型往往无法从实验室到现场条件进行扩展。在这里，我们介绍实验工具，以两个空间尺度研究多孔介质中的细菌运输。这些工具的目的是获得注入透明多孔基质的细菌的宏观可观测（如突破性曲线或沉积剖面）。在小规模（10-1000 μm）下，微流体器件与光学视频显微镜和图像处理相结合，获得突破性曲线，同时在孔隙尺度上跟踪单个细菌细胞。在更大的尺度上，流式细胞仪与自制的机器人分配器相结合，获得突破性曲线。我们演示了这些工具的效用，以更好地了解细菌是如何在复杂的多孔介质中（如溪流的低血区）中运输的。由于这些工具提供跨比例的同步测量，因此它们为基于机制的模型铺平了道路，对于上小范围至关重要。这些工具的应用不仅有助于新型生物修复应用的发展，而且为多孔基材的微生物殖民化生态策略提供了新的阐明。

Introduction

旨在了解微生物通过多孔介质的运输的研究主要受到污染^1、疾病^{2和生物修复3的传播的关注}。在这方面，细菌大多在运输模型4中被当作^{粒子处理，生物}膜的过滤、应变、重力沉降或再移动化等过程被确定为微生物5的保留或运输的^驱动因素。然而，研究细菌通过多孔景观的运输也可以告诉我们的生态策略，支撑他们成功地在这些复杂的环境中。然而，这需要新的实验和数学模型在单细胞，种群或微生物群落水平运行。

天然多孔环境，如在溪流和河流低血区发现的环境，由不同群落的生膜形成微生物^{6密集地殖民}。生物膜形成结构，改变流动，从而在液体阶段^,7，8中运输和^分散细菌。以孔隙尺度运输细菌取决于多孔基质中空间有限，而与运动相关的分散可能是通过减少人口较少地区的资源竞争来提高个体 体质的有效方法。另一方面，动体细菌也可以到达多孔基质的更孤立的区域，而对这些地区的扩展探索可能为¹⁰个活动种群提供生态机会。在较大的空间尺度上，生物膜的生长也会转移流动路径，也导致（部分）毛孔堵塞，从而形成更通道化和异构的流动条件^11。这对营养供应和分散能力、频率和距离有影响。例如，优先流动可以产生所谓的”快速通道”，移动细菌可以达到比沿这些轨道¹²的局部流动更高的速度。这是增加对新生境探索的有效方法。

各种工具可用于研究多孔介质中移动细菌和非动性细菌（和颗粒）的运输。数字模型具有强大的预测能力，对于应用非常重要，但通常受到固有假设^{4 的有限限制}。实验室规模实验^13、14和突破性曲线（BTC）建模为细菌细胞表面特性粘附效率^{15的重要性提供了重要的见解}。^13,通常，BTC（即固定位置的粒子浓度时间序列）是通过恒定速率释放和测量实验设备流出时细胞数获得的。在这种情况下，BTC 反映了多孔基质中细菌的对流分散动力学，并且可以通过一个入汇术语来扩展附着。然而，仅对BTC进行建模并不能解决多孔基板或生物膜在运输过程中的空间组织作用。其他宏观观测，如分散性或沉积剖面，已被证明提供了有关空间分布或保留的粒子或生长群落的重要信息。微流体是一种技术，它允许通过^{显微镜调查9，12，16,12,16}研究多孔介质的传输，除了最近的^工作10，实验系统通常被限制在一个单一长度的分辨率尺度，即孔隙刻度或整个流体器件尺度。

在这里，我们介绍一套组合方法，研究不同尺度的多孔景观中莫蒂细菌和非动性细菌的运输。通过BTC分析，我们将孔径尺度细菌运输的观测与较大规模的信息相结合。使用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 的软光度印刷制造的微流体器件与生物相容，耐多种化学品，成本低，具有极佳的光学透明度和低自荧光，对微观观察至关重要。基于PDMS的微流体以前曾用于研究简单通道^{17或更复杂的几何体12} 中微生物的^传输。然而，通常微流体实验侧重于短期视界，活细胞的荧光显微观察通常仅限于转基因菌株（例如，GFP标记菌株）。在这里，我们介绍的工具，使用基于PDMS的微流体设备，结合显微镜和更大的设备，由聚（甲基甲基丙烯酸酯）（PMMA，也称为有机玻璃）结合流细胞仪，研究细菌运输。PDMS 和 PMMA 在气体渗透性和表面性能方面有所不同，从而为研究细菌运输提供了互补的机会。虽然微流体器件提供了更可控的环境，但较大的设备允许在较长时间内进行实验或使用天然细菌群落。在专用区域中，以高时分辨率进行显微计数用于在基于 PDMS 的微流体器件中获取 BTC。为了从基于PMMA的设备获取BTC建模的细胞计数，我们引入了一个自建的自动液体分配器，结合流式细胞仪。在此设置中，电池通过流体装置，并连续分配到 96 个孔板中。时态分辨率受可精确分配的最小体积的限制，从而通过流体装置的中流速。井中的固定剂可防止生长，并促进下游流-细胞计量枚举的DNA染色。为了防止运输实验期间细菌生长，我们使用最小的中培养液（术语运动缓冲液）。

由于不同尺度的流体器件制备协议是现成的，我们只简要介绍生产此类器件的技术，而只关注记录 BTC 的实验程序。同样，对于微生物的流动细胞学枚举存在各种程序，用户需要专业知识来解释流式细胞学获得的结果。我们报告了微流体器件与显微成像相结合的新用途，以记录荧光标记细胞的BTC。在孔隙尺度上，通过图像处理获得局部速度和轨迹。此外，我们演示了使用基于 PMMA 的流体装置与流-细胞计量计数相结合，以观察由原生流生物膜殖民的多孔环境中的动体和非动性细胞的细菌传输。

Protocol

1. 细菌培养条件 在层流罩下工作，使用 100 μL 的甘油库存的 GFP 标记 伪莫纳斯 putida KT2440 （1 × 107 mL-1，储存在 -80 °C） 接种 5 mL 的 Luria-Bertani （LB） 介质。在 30 °C 下孵育，同时在 250 rpm 下摇晃过夜。 第二天，在5 mL LB培养基中重新暂停100μL的隔夜培养，并在相同的条件下孵育5小时（指数相）。将 1 mL 等分样品取样到 2 mL 管中，冷却至室温（约 15 分钟）和?…

Representative Results

为了说明所呈现的工作流程的功能，我们使用转基因伪多莫纳斯普蒂达KT2440进行了实验，这是一种对生物修复和生物技术非常重要的克阴性动体细菌。这种表达GP生产的菌株的转基因版本是商用的。一种缺乏相关结构和调节基因的P.putida KT2440非动性菌株也可用。使用同时标记P. putida KT2440 的动量 GFP，我们在 PDMS 微流体器件中进行了连续实验，并随机排?…

Discussion

在这里，我们提出了两种研究微生物在单细胞和种群层面通过多孔系统的传输方法。虽然使用BTC建模对运输现象的研究为生态系统尺度上病原体或污染物的传播提供了宝贵的见解，但从实验室实验到田间条件的规模扩展方面仍然存在困难。此处描述的工具使研究人员能够实验性地解决空间和时间尺度，以便更好地了解与多孔环境中的运输相关的微生物的生态策略。实验者可以使用或修改这些系统?…

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron