Summary

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

Published: November 25, 2020
doi:

Summary

획기적인 곡선(BtC)은 다공성 미디어에서 박테리아의 운반을 연구하는 효율적인 도구입니다. 여기에서는 현미경 검사법과 유동 세포계 계수와 함께 유체 장치를 기반으로 한 도구를 소개하여 BtC를 획득합니다.

Abstract

다공성 미디어에서 미생물의 운송, 분산 및 증착을 이해하는 것은 유체 역학, 생태 및 환경 공학과 같은 다양한 주제로 구성된 복잡한 과학적 과제입니다. 다양한 공간 비늘에서 다공성 환경에서 세균 수송을 모델링하는 것은 세균 수송의 결과를 더 잘 예측하는 데 매우 중요하지만 현재 모델은 종종 실험실에서 현장 조건으로 확장하지 못합니다. 여기서는 두 개의 공간 비늘에서 다공성 매체의 세균 수송을 연구하는 실험 도구를 소개합니다. 이러한 도구의 목적은 투명 다공성 행렬에 주입 된 박테리아의 거시적 인 관찰물 (예 : 획기적인 곡선 또는 증착 프로파일)을 얻는 것입니다. 작은 규모(10-1000 μm)에서 미세유체 장치는 광학 비디오 현미경 및 이미지 처리와 결합되어 획기적인 곡선을 얻고 동시에 개별 세균 세포를 모공 스케일로 추적합니다. 더 큰 규모로, 유동 세포측정은 획기적인 곡선을 얻기 위해 자체 제작 로봇 디스펜서와 결합됩니다. 우리는 박테리아가 스트림의 저압 영역과 같은 복잡한 다공성 매체에서 어떻게 운반되는지 더 잘 이해하기 위해 이러한 도구의 유용성을 보여줍니다. 이러한 도구는 스케일 전반에 걸쳐 동시 측정을 제공하므로 업스케일링에 매우 중요한 메커니즘 기반 모델을 위한 길을 열어줍니다. 이러한 도구의 적용은 새로운 생물 교정 응용 프로그램의 개발에 기여할뿐만 아니라 다공성 기판을 식민지화 하는 미생물의 생태 전략에 새로운 빛을 발산 할 수 있습니다.

Introduction

다공성 매체를 통한 미생물의 수송을 이해하는 것을 목표로 하는 연구는 주로 오염1,질병2 및 생물 교정3의전염에 대한 우려에 의해 주도되었다. 이와 관련하여, 박테리아는 주로 수송 모델4에서 입자로 취급되고 있으며, 생물막으로부터여비, 긴장, 중력 침전 또는 재동원과 같은 공정은 미생물의 유지 또는 수송의 동인으로 확인되었다5. 그러나 다공성 경관을 통해 박테리아의 수송을 연구하는 것은 또한 이러한 복잡한 환경에서 성공을 뒷받침하는 생태 전략에 알려줄 수 있습니다. 그러나, 이것은 단 하나 세포, 인구 또는 미생물 지역 사회 수준에서 작동하는 새로운 실험 및 수학 모형을 요구합니다.

하천과 하천의 저압 구역에서 발견되는 것과 같은 자연 다공성 환경은 생물막 형성 미생물6의다양한 지역 사회에 의해 조밀하게 식민지화된다. 생물막은 액체 상7,,8에서박테리아의 흐름을 수정하고 따라서 박테리아의 수송 및 분산구조를 형성한다. 모공 규모에서 박테리아의 수송은 다공성 매트릭스및 운동성 관련 분산물의 제한된 공간 가용성에 따라 달라지며, 인구밀도가 낮은 지역에서 자원에 대한 경쟁 감소를 통해 개별 체력을 높이는 효과적인 방법이 될 수 있다. 한편, 운동성 균은 다공성 매트릭스의 더 고립된 영역에 도달할 수 있으며, 이러한 지역의 확장된 탐사는운동인구(10)에생태학적 기회를 제공할 수 있다. 더 큰 공간 비늘에서, 생물막 성장은 또한 모공의 (부분) 막힘으로 이어지는 흐름 경로를 전환하고, 따라서, 더욱 집중화및 이질적인 유량조건(11)의확립에 이르게 한다. 이것은 영양 공급 및 분산 용량, 주파수 및 거리에 대한 결과를 초래합니다. 예를 들어, 우대 흐름은 소위 “패스트 트랙”을 생성할 수 있으며, 운동균은 이트랙(12)을따라 로컬 흐름보다 더 높은 속도를 달성할 수 있다. 이것은 새로운 서식지의 탐험을 증가시키는 효과적인 방법입니다.

다양한 도구는 다공성 매체에서 운동및 비운동성 박테리아(및 입자)의 수송을 연구하기 위해 이용합니다. 수치 모델은 응용 프로그램에 중요한 훌륭한 예측 능력을 가지고 있지만, 종종 고유의 가정4에의해 제한됩니다. 실험실 규모 실험13,,14와 획기적인 곡선(BTC) 모델링이 결합되어 고착효율(15)을위한 세균세포 표면 특성의 중요성에 중요한 통찰력을 제공한다. 전형적으로, BtC(즉, 고정된 위치에서 입자 농도의 시간 시리즈)는 실험 장치의 유출시 셀 번호의 일정 속도 방출 및 측정을 통해 얻어진다. 이러한 맥락에서, BtC는 다공성 매트릭스내 박테리아의 흡착-분산 역학을 반영하고 부착을 고려한 싱크 용어에 의해 확장될 수 있다. 그러나, 혼자 BtC의 모델링은 운송 공정을 위한 다공성 기질 또는 생물막의 공간 조직의 역할을 해결하지 못합니다. 분산성 또는 증착 프로파일과 같은 다른 거시적 관찰은 공간 분포 또는 유지된 입자 또는 성장하는 커뮤니티에 대한 중요한 정보를 제공하는 것으로 입증되었습니다. 미세유체는 현미경 조사9,12,,16에의해 다공성 미디어에서 수송을 연구할 수 있는 기술이며, 최근작업(10)을제외하고, 실험 시스템은 전형적으로 단일 길이의 해상도, 즉, 기공 스케일 또는 전체 유체 장치 스케일로 제한된다.,

여기서는 다양한 비늘의 다공성 풍경에서 모틸류 와 비 운동성 박테리아의 수송을 연구하는 결합 된 방법의 제품군을 소개합니다. 우리는 BTC 분석을 통해 더 큰 규모의 정보와 모공 규모에서 세균 수송의 관찰을 결합합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 연약한 리소그래피로 제작된 미세유체 장치는 다양한 화학 물질에 대한 생체 적합성, 낮은 비용으로 복제성을 허용하며, 미세한 관찰에 중요한 낮은 광학 적 투명성뿐만 아니라 낮은 광학 적 투명성을 제공합니다. PDMS에 기초한 미세 유체학은 이전에 간단한채널(17) 또는 더 복잡한 기하학(12)에서 미생물의 수송을 연구하는 데 사용되어 왔다.12 그러나, 전형적으로 미세유체학 실험은 살아있는 세포의 단기 지평선 및 에피 형광 현미경 관측에 초점을 맞추고 일반적으로 유전자 변형 균주(예를 들어, GFP 태그된 균주)로 제한됩니다. 여기서 우리는 유동 세포측정과 함께 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA, 플렉시유리라고도 함)에서 제작된 현미경 검사법과 더 큰 장치와 함께 PDMS 기반 의 미세 유체 장치를 사용하여 세균 수송을 연구하는 도구를 제시합니다. PDMS와 PMMA는 가스 투과성 및 표면 특성이 다르므로 세균 수송을 연구할 수 있는 보완적인 기회를 제공합니다. 미세 유체 장치는 보다 통제된 환경을 제공하지만, 더 큰 장치는 장기간 또는 자연 세균 커뮤니티를 사용하여 실험을 할 수 있습니다. 전용 영역에서 고시간 분해능에서 계산되는 현미경 은 PDMS 기반 미세 유체 장치에서 BTC를 획득하는 데 사용됩니다. PMMA 기반 장치에서 BTC 모델링에 대한 셀 카운트를 얻기 위해 유동 세포 측정과 결합하여 자체 제작 된 자동화 된 액체 디스펜서를 소개합니다. 이 설정에서, 세포는 유체 장치를 통과하고 연속적으로 96 웰 플레이트로 분배된다. 측두해상도는 유체 장치를 통해 정확하게 분배될 수 있는 최소 부피에 의해 제한되고 따라서 중간 유량에 의해 제한됩니다. 우물의 고정은 성장을 방지하고 다운스트림 흐름- 사이토메트릭 열거에 대한 DNA 염색을 용이하게합니다. 운송 실험 중 세균 성장을 방지하기 위해 최소한의 중간(운동완 완충이라고 불임)을 사용합니다.

다양한 비늘에서 유체 장치 제조를 위한 프로토콜을 쉽게 사용할 수 있기 때문에 이러한 장치를 생산하고 오히려 BtC를 기록하는 실험 절차에 집중하는 기술을 간단히 소개합니다. 유사하게, 미생물의 유동 세포측정 열거에 대한 다양한 루틴이 존재하며 사용자는 유동 세포측정에 의해 얻은 결과를 해석하기 위해 전문가 지식을 필요로 한다. 우리는 형광 태그 세포의 BtC를 기록하기 위해 현미경 이미징과 함께 미세 유체 장치의 새로운 사용을보고합니다. 모공 스케일에서 로컬 속도와 궤적은 이미지 처리를 통해 얻을 수 있습니다. 또한, 우리는 원시 스트림 생물막에 의해 식민지화 다공성 환경에서 연약및 비 연약 세포의 세균수송을 관찰하기 위해 유량 세포계 계수와 결합하여 PMMA 기반 유체 장치의 사용을 입증한다.

Protocol

1. 세균 배양 조건 라미나르 유동 후드 하에서 작업하면, GFP 태그가 지정된 슈도모나스 푸티다 KT2440(1× 107mL -1,-80°C에 저장됨)의 글리세롤 스톡 100μL을 사용하여 루리아-베르타니(LB) 배지의 5mL를 접종한다. 하룻밤 사이에 250 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 배양하십시오. 다음 날, 5mL LB 배지에서 야간 배양100 μL을 재중단하고 5h(지수상)에 대해 동일한 조건하에서 배…

Representative Results

제시된 워크플로우의 기능을 설명하기 위해, 우리는 유전자 변형 슈도모나스 푸티다 KT2440, 생체 치료 및 생명 공학에 중요한 그램 음성 운동균을 사용하여 실험을 수행했습니다. GFP 생산을 발현하는 이 균주의 유전자 변형 버전은 시판됩니다. 운동성에 대한 관련 구조 및 규제 유전자가 부족한 P. putida KT2440의 비운동균도 사용할 수 있습니다. 모틸및비운동성 …

Discussion

여기서 우리는 단일 세포와 인구 수준에서 다공성 시스템을 통해 미생물의 수송을 연구하는 두 가지 수단을 제안한다. BTC 모델링을 이용한 운송 현상에 대한 연구는 생태계 척도에서 병원균이나 오염물질의 확산에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만 실험실 실험에서 현장 조건으로 확장하는 데 어려움이 여전히 존재합니다. 여기에 설명된 도구는 다공성 환경에서 수송과 관련된 미생물의 생태 전…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 로봇 디스펜서와 dispenser.py 스크립트의 설정으로 앙토안 위드머의 도움을 인정합니다.

Materials

EDTA Sigma
Elastomer Sylgard 184 Dowsil 101697
Flow cytometer NovoCyte Acea
Glucose Sigma https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit makeblock
Microscope Axio Imager Zeiss
Microscope AxioZoom v16 Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm Corning
Minipuls 3 peristaltic pump Gilson
Plasma bonder Corona SB BlackHole Lab
Potassium phosphate Sigma
Syringe pump New Era NE 4000 New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing Ismatec
WF31SA universal milling machine Mikron

References

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Citer Cet Article
Scheidweiler, D., De Anna, P., Battin, T. J., Peter, H. Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (165), e60701, doi:10.3791/60701 (2020).

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