Combinando dispositivos fluidos com microscopia e citometria de fluxo para estudar transporte microbiano em mídia porosa em escalas espaciais

Summary

Curvas inovadoras (BTCs) são ferramentas eficientes para estudar o transporte de bactérias em mídia porosa. Aqui introduzimos ferramentas baseadas em dispositivos fluidos em combinação com microscopia e contagem citométrica de fluxo para obter BTCs.

Abstract

Compreender o transporte, dispersão e deposição de microrganismos na mídia porosa é uma tarefa científica complexa que compreende temas tão diversos quanto hidrodinâmica, ecologia e engenharia ambiental. A modelagem do transporte bacteriano em ambientes porosos em diferentes escalas espaciais é fundamental para prever melhor as consequências do transporte bacteriano, mas os modelos atuais muitas vezes não conseguem subir de laboratório para condições de campo. Aqui, introduzimos ferramentas experimentais para estudar o transporte bacteriano em meios porosos em duas escalas espaciais. O objetivo dessas ferramentas é obter observações macroscópicas (como curvas inovadoras ou perfis de deposição) de bactérias injetadas em matrizes porosas transparentes. Na pequena escala (10-1000 μm), os dispositivos microfluidos são combinados com microscopia de vídeo óptico e processamento de imagem para obter curvas inovadoras e, ao mesmo tempo, rastrear células bacterianas individuais na escala de poros. Em maior escala, a citometria de fluxo é combinada com um dispensador robótico auto-fabricado para obter curvas inovadoras. Ilustramos a utilidade dessas ferramentas para entender melhor como as bactérias são transportadas em mídias porosas complexas, como a zona hiporérica dos córregos. Como essas ferramentas fornecem medições simultâneas em escalas, elas abrem caminho para modelos baseados em mecanismos, criticamente importantes para o upscaling. A aplicação dessas ferramentas pode não apenas contribuir para o desenvolvimento de novas aplicações de bioremediação, mas também lançar uma nova luz sobre as estratégias ecológicas dos microrganismos colonizando substratos porosos.

Introduction

Estudos com o objetivo de compreender o transporte de micróbios por meio de mídia porosa têm sido impulsionados principalmente por preocupações de contaminação¹, transmissão da doença² e bioremediação³. Nesse sentido, as bactérias têm sido tratadas principalmente como partículas nos modelos de transporte⁴ e processos como filtragem, tensão, fixação gravitacional ou remobilização de biofilmes têm sido identificados como condutores de retenção ou transporte de micróbios⁵. No entanto, estudar o transporte de bactérias através de paisagens porosas também pode nos informar sobre as estratégias ecológicas que sustentam seu sucesso nesses ambientes complexos. No entanto, isso requer novos experimentos e modelos matemáticos operando em nível único de célula, população ou comunidade microbiana.

Ambientes porosos naturais, como os encontrados na zona hiporérica de córregos e rios, são densamente colonizados por diversas comunidades de micróbios formadores de biofilmes⁶. Os biofilmes formam estruturas que modificam o fluxo e, portanto, o transporte e dispersão de bactérias na fase líquida^7,8. O transporte de bactérias em escala de poros depende da disponibilidade de espaço restrita na matriz porosa e a dispersão relacionada à motilidade pode ser uma maneira eficaz de aumentar o condicionamento físico individual através da redução da concorrência por recursos em áreas menos densamente povoadas. Por outro lado, as bactérias motile também podem atingir regiões mais isoladas da matriz porosa e a exploração prolongada dessas áreas pode proporcionar oportunidades ecológicas para as populações¹⁰. Em escalas espaciais maiores, o crescimento do biofilme desvia os caminhos de fluxo também levando ao entupimento (parcial) dos poros e, assim, ao estabelecimento de condições de fluxo ainda mais canalizadas e heterogêneas¹¹. Isso tem consequências para o fornecimento de nutrientes e capacidade de dispersão, frequência e distância. O fluxo preferencial, por exemplo, pode gerar as chamadas “faixas rápidas” e as bactérias motile podem atingir velocidades ainda mais altas do que o fluxo local ao longo dessas faixas¹². Esta é uma maneira eficaz de aumentar a exploração de novos habitats.

Uma variedade de ferramentas se aproveitam para o estudo do transporte de bactérias motile e não-motile (e partículas) em meios porosos. Modelos numéricos têm grandes capacidades preditivas importantes para aplicações, porém muitas vezes são limitados por pressupostos inerentes⁴. Experimentos em escala de laboratório^13,14 combinados com modelagem de curva inovadora (BTC) forneceram insights importantes sobre a importância das propriedades da superfície celular bacteriana para a eficiência da aderência¹⁵. Normalmente, os BTCs (ou seja, vezes a série de concentração de partículas em um local fixo) são obtidos através de versões de taxa constante e medição de números de células no fluxo de saída do dispositivo experimental. Nesse contexto, os BTCs refletem a dinâmica de dispersão de advecção das bactérias na matriz porosa e podem ser estendidos por um termo de pia que contabiliza o apego. No entanto, a modelagem de BTCs por si só não resolve o papel da organização espacial do substrato poroso ou biofilme para processos de transporte. Outros observáveis macroscópicos, como perfis de dispersividade ou deposição, provaram fornecer informações importantes sobre a distribuição espacial ou as partículas retidas ou comunidades em crescimento. Microfluidos é uma tecnologia que permite estudar o transporte em mídia porosa por investigação de microscopia^9,,12,,16, e exceto um trabalho recente¹⁰, sistemas experimentais são tipicamente limitados a uma única escala de comprimento de resolução, ou seja, a escala de poros ou toda a escala de dispositivo fluido.

Aqui, introduzimos um conjunto de métodos combinados para estudar o transporte de bactérias motile e não-motile em paisagens porosas em diferentes escalas. Combinamos observações de transporte bacteriano na escala de poros com informações em maior escala, por meio da análise do BTC. Dispositivos microfluidos construídos a partir da litografia macia usando polidimtilsiloxano (PDMS) são biocompatíveis, resistentes a uma gama de produtos químicos, permitem a replicabilidade a baixo custo e fornecem excelente transparência óptica, bem como baixa autofluorescência crítica para observação microscópica. Microfluidos baseados em PDMS tem sido usado anteriormente para estudar o transporte de micróbios nos canais simples¹⁷ ou em geometrias mais complexas¹². No entanto, experimentos tipicamente microfluidos se concentram em horizontes de curto prazo e a observação microscópica epi-fluorescência de células vivas é comumente restrita a cepas geneticamente modificadas (por exemplo, cepas marcadas por GFP). Aqui apresentamos ferramentas para estudar o transporte bacteriano usando dispositivos microfluidos baseados em PDMS em combinação com microscopia e dispositivos maiores fabricados a partir de poli (metil methacrilate) (PMMA, também conhecido como plexiglass) em combinação com citometria de fluxo. PDMS e PMMA diferem na permeabilidade do gás e nas propriedades superficiais, proporcionando oportunidades complementares para estudar o transporte bacteriano. Embora o dispositivo microfluido forneça um ambiente mais controlado, o dispositivo maior permite experimentos por longos períodos de tempo ou usando comunidades bacterianas naturais. A contagem de microscopia em alta resolução temporal em uma área dedicada é usada para obter BTC no dispositivo microfluido baseado em PDMS. Para obter contagem de células para modelagem de BTC a partir do dispositivo baseado em PMMA, introduzimos um distribuidor líquido automatizado auto-construído em combinação com citometria de fluxo. Nesta configuração, as células passam o dispositivo fluido e são consecutivamente dispensadas em 96 placas de poço. A resolução temporal é restrita pelo volume mínimo que pode ser dispensado com precisão e, portanto, pela taxa média de fluxo através do dispositivo fluido. Fixação nos poços previne o crescimento e facilita a coloração do DNA para enumeração fluxo-citométrica a jusante. Para evitar o crescimento bacteriano durante os experimentos de transporte, usamos um meio mínimo (tampão de motilidade a termo).

Uma vez que os protocolos para a preparação de dispositivos fluidos em diferentes escalas estão prontamente disponíveis, apenas introduzimos brevemente as técnicas para produzir tais dispositivos e, em vez disso, focamos nos procedimentos experimentais para gravar BTCs. Da mesma forma, existem várias rotinas para a enumeração citométrica de fluxo de micróbios e os usuários exigem conhecimento especializado para interpretar resultados obtidos pela citometria de fluxo. Relatamos o novo uso de dispositivos microfluidos em combinação com imagens microscópicas para registrar BTCs de células fluorescentes marcadas. Na escala de poros, as velocidades e trajetórias locais são obtidas por meio do processamento de imagens. Além disso, demonstramos o uso de um dispositivo fluido baseado em PMMA em combinação com a contagem flutormétrica para observar o transporte bacteriano de células motile e não-motile em ambientes porosos colonizados por um biofilme de fluxo nativo.

Protocol

1. Condições de cultura bacteriana Trabalhando sob uma capa de fluxo laminar, use 100 μL de um estoque de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, armazenado a -80 °C) para inocular 5 mL de meio Luria-Bertani (LB). Incubar a 30 °C enquanto treme a 250 rpm durante a noite. No dia seguinte, resuspense 100 μL da cultura noturna em 5 mL LB médio e incubar sob as mesmas condições por 5h (fase exponencial). Prove uma alíquota de 1 mL em um tubo de 2 mL, …

Representative Results

Para ilustrar a funcionalidade do fluxo de trabalho apresentado, realizamos experimentos utilizando pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificada, uma bactéria motile negativa grama importante para bioremediação e biotecnologia. Versões geneticamente modificadas desta cepa que expressam a produção de GFP estão disponíveis comercialmente. Uma cepa não motil de P. putida KT2440 que não possui os genes estruturais e regulatórios relevantes para a motilidade …

Discussion

Aqui sugerimos dois meios para estudar o transporte de micróbios através de sistemas porosos no nível unicelular e populacional. Embora o estudo dos fenômenos de transporte usando modelagem de BTC tenha fornecido insights valiosos sobre a disseminação de patógenos ou contaminantes nas escalas do ecossistema, as dificuldades de dimensionar de experimentos de laboratório para condições de campo ainda existem. As ferramentas aqui descritas permitem aos pesquisadores resolver experimentalmente as escalas espaciais …

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron