Объединение жидкостных устройств с микроскопией и цитометрией потока для изучения микробного транспорта в пористых средствах массовой информации через пространственные весы
Summary
Прорыв кривых (BTCs) являются эффективными инструментами для изучения транспортировки бактерий в пористых средств массовой информации. Здесь мы представляем инструменты, основанные на жидкостных устройствах в сочетании с микроскопией и цитометрическим подсчетом потока для получения БТК.
Abstract
Понимание транспорта, рассеивания и осаждения микроорганизмов в пористых средствах массовой информации является сложной научной задачей, включающей такие разнообразные темы, как гидродинамика, экология и экологическая инженерия. Моделирование бактериального транспорта в пористых средах в различных пространственных масштабах имеет решающее значение для лучшего прогнозирования последствий бактериального транспорта, однако нынешние модели часто не могут масштабироваться от лабораторных к полевым условиям. Здесь мы представляем экспериментальные инструменты для изучения бактериального транспорта в пористых средствах массовой информации в двух пространственных масштабах. Цель этих инструментов состоит в том, чтобы получить макроскопические наблюдаемые (такие как прорыв кривых или осаждения профилей) бактерий, введенных в прозрачные пористые матрицы. В малых масштабах (10-1000 мкм) микрофлюидные устройства сочетаются с оптической видео-микроскопией и обработкой изображений для получения прорывных кривых и, в то же время, для отслеживания отдельных бактериальных клеток в порной шкале. В более широком масштабе цитометрия потока сочетается с самодельным роботизированным дозатором для получения прорывных кривых. Мы иллюстрируют полезность этих инструментов, чтобы лучше понять, как бактерии транспортируются в сложных пористых средствах массовой информации, таких как гипорхейная зона потоков. Поскольку эти инструменты обеспечивают одновременные измерения в масштабах, они прокладывают путь для моделей на основе механизмов, критически важных для перенаписьвания. Применение этих инструментов может не только способствовать разработке новых методов биовосстановления, но и пролить новый свет на экологические стратегии микроорганизмов колонизации пористых субстратов.
Introduction
Исследования, направленные на понимание транспортировки микробов через пористые средства массовой информации в основном былиобусловлены опасениями загрязнения 1,передачи болезни 2 и биовосстановления3. В этой связи бактерии в основном рассматриваются как частицы втранспортных моделях 4 и такие процессы, как фильтрация, напряжение, гравитационное оседают или ремобилизации из биопленки были определены в качестве драйверов удержания или транспортировкимикробов 5. Тем не менее, изучение транспортировки бактерий через пористые ландшафты может также информировать нас об экологических стратегиях, лежащих в основе их успеха в этих сложных средах. Тем не менее, это требует новых экспериментов и математических моделей, работающих на уровне одной клетки, популяции или микробного сообщества.
Природные пористые среды, такие как те, которые находятся в гипорхейской зоне ручьев и рек, плотно колонизированы различными сообществами биопленообразующихмикробов 6. Биопленки образуют структуры, которые изменяют поток и, таким образом, транспортировку и рассеивание бактерий в жидкойфазе 7,,8. Транспортировка бактерий в поровом масштабе зависит от ограниченной доступности пространства в пористой матрице, и рассеивание, связанное с подвижностью, может быть эффективным способом повышения физической подготовки отдельных людей за счет снижения конкуренции за ресурсы в менее густонаселенных районах. С другой стороны, подвижные бактерии могут также достигать более изолированных областей пористой матрицы и расширенное исследование таких районов может обеспечить экологические возможности для подвижнойпопуляции 10. В больших пространственных масштабах рост биопленки отвлекает пути потока, также ведущие к (частичному) засорему пор и, таким образом, к созданию еще более ченнелингов и неоднородныхусловий потока 11. Это имеет последствия для способности к поставкам и рассеиванию питательных веществ, частоте и расстоянию. Преференциальный поток, например, может генерировать так называемые “быстрые треки” и пестрые бактерии могут достигать еще более высоких скоростей, чем локальный поток вдоль этихтреков 12. Это эффективный способ увеличить разведку новых мест обитания.
Различные инструменты используются для изучения транспортировки пестрых и недвижимых бактерий (и частиц) в пористых средствах массовой информации. Численные модели имеют большие прогностический потенциал, важный для приложений, однако часто ограничены присущимипредположениям 4. Лабораторные эксперименты13,14 всочетании с прорывом кривой (BTC) моделирования предоставили важные идеи в важности бактериальных свойств поверхности клеток для прилипанияэффективности 15. Как правило, БТК (т.е. серия времени концентрации частиц в фиксированном месте) получаются с помощью постоянных выбросов скорости и измерения числа клеток при оттоке экспериментального устройства. В этом контексте БТК отражают динамику дисперсии бактерий в пористой матрице и могут быть расширены термином раковины, учитывая привязанность. Однако моделирование БТР само по себе не решает роли пространственной организации пористого субстрата или биопленки для транспортных процессов. Было доказано, что другие макроскопические наблюдаемые факторы, такие как дисперсия или профили осаждения, предоставляют важную информацию о пространственном распределении или сохраненных частицах или растущих сообществах. Микрофлюиды это технология, которая позволяет изучать транспорт в пористых средствахмассовой информации с помощью микроскопии исследования 9,12,16, и заисключением недавней работы 10, экспериментальные системы, как правило, ограничены одной шкале длины разрешения, то есть, поры масштаба или всей жидкости масштаба устройства.
Здесь мы представляем набор комбинированных методов для изучения транспортировки подвижных и немостоялых бактерий в пористых ландшафтах в различных масштабах. Мы сочетаем наблюдения за бактериальным транспортом в поровом масштабе с информацией в более широком масштабе с помощью анализа BTC. Микрофлюидные устройства, построенные из мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS), биосовместимы, устойчивы к ряду химических веществ, позволяют воспроизводиться при низких затратах и обеспечивают отличную оптическую прозрачность, а также низкую аутофторесценцию, критически важную для микроскопических наблюдений. Микрофлюиды на основе PDMS ранее использовались для изучения транспортировки микробов в простыхканалах 17 или в более сложных геометриях12. Тем не менее, как правило, эксперименты микрофлюиды сосредоточиться на краткосрочных горизонтов и эпи-флуоресценции микроскопического наблюдения живых клеток, как правило, ограничивается генетически модифицированных штаммов (например, GFP-тегами штаммов). Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств на основе PDMS в сочетании с микроскопией и более крупными устройствами, изготовленными из поли (метил-метакрилата) (PMMA, также известного как плексиглас) в сочетании с цитометрией потока. PDMS и PMMA отличаются проницаемостью газа и поверхностными свойствами, тем самым предоставляя дополнительные возможности для изучения бактериального транспорта. В то время как микрофлюидное устройство обеспечивает более контролируемую среду, более крупное устройство позволяет проводить эксперименты в течение длительных периодов времени или с использованием естественных бактериальных сообществ. Микроскопия, подсчитываемая при высоком временном разрешении в выделенной области, используется для получения BTC в микрофлюидных устройствах на основе PDMS. Чтобы получить количество ячеев для моделирования BTC с устройства на основе PMMA, мы вводим самосконструируемый автоматизированный жидкий дозатор в сочетании с цитометрией потока. В этой установке, клетки проходят жидкостное устройство и последовательно распределяется в 96 пластин хорошо. Временное разрешение ограничено минимальным объемом, который можно точно распределить, и, таким образом, средней скоростью потока через жидкое устройство. Фиксация в скважинах предотвращает рост и облегчает окрашивание ДНК для нисходящего потока-цитометрического перечисления. Для предотвращения роста бактерий в ходе транспортных экспериментов мы используем минимальную среду (такую же подвижность буфера).
Поскольку протоколы по подготовке жидкостных устройств в различных масштабах легко доступны, мы лишь кратко вводим методы производства таких устройств и, скорее, сосредоточиваемся на экспериментальных процедурах записи БТК. Аналогичным образом существуют различные процедуры для цитометрического перечисления потока микробов, и пользователи требуют экспертных знаний для интерпретации результатов, полученных с помощью цитометрии потока. Мы сообщаем о новой использовании микрофлюидных устройств в сочетании с микроскопической визуализацией для записи БТК клеток с флуоресцентными тегами. В поровом масштабе локальные скорости и траектории получаются с помощью обработки изображений. Кроме того, мы демонстрируем использование жидкого устройства на основе PMMA в сочетании с потоко-цитометрическим подсчетом для наблюдения за бактериальной транспортировкой подвижных и недвижимых клеток в пористых средах, колонизированных биопленкой родного потока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предлагаем два средства для изучения транспортировки микробов через пористые системы на одноклеточном и популяционные уровни. Хотя изучение транспортных явлений с использованием моделирования БТД дало ценную информацию о распространении патогенных микроорганизмов или заг…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем помощь Антуана Видмера с установкой роботизированного дозатора и dispenser.py скрипта.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
