Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales
Summary
Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.
Abstract
Comprender el transporte, dispersión y deposición de microorganismos en medios porosos es una tarea científica compleja que comprende temas tan diversos como la hidrodinámica, la ecología y la ingeniería ambiental. Modelar el transporte bacteriano en entornos porosos a diferentes escalas espaciales es fundamental para predecir mejor las consecuencias del transporte bacteriano, pero los modelos actuales a menudo no logran escalar de laboratorio a condiciones de campo. Aquí, introducimos herramientas experimentales para estudiar el transporte bacteriano en medios porosos a dos escalas espaciales. El objetivo de estas herramientas es obtener observables macroscópicos (como curvas de ruptura o perfiles de deposición) de bacterias inyectadas en matrices porosas transparentes. A pequeña escala (10-1000 m), los dispositivos microfluídicos se combinan con video-microscopía óptica y procesamiento de imágenes para obtener curvas de ruptura y, al mismo tiempo, para rastrear células bacterianas individuales a escala de poros. A mayor escala, la citometría de flujo se combina con un dispensador robótico hecho a sí mismo para obtener curvas de ruptura. Ilustramos la utilidad de estas herramientas para entender mejor cómo se transportan las bacterias en medios porosos complejos como la zona hiporheica de los arroyos. Como estas herramientas proporcionan mediciones simultáneas a través de escalas, allanan el camino para modelos basados en mecanismos, de vital importancia para la ampliación. La aplicación de estas herramientas puede no sólo contribuir al desarrollo de nuevas aplicaciones de biorremediación, sino que también arrojar nueva luz sobre las estrategias ecológicas de los microorganismos colonizando sustratos porosos.
Introduction
Los estudios enca de comprender el transporte de microbios a través de medios porosos han sido impulsados principalmente por preocupaciones de contaminación1, la transmisión de la enfermedad2 y la biorremediación3. En este sentido, las bacterias han sido tratadas principalmente como partículas en los modelos de transporte4 y se han identificado procesos como filtración, tensión, sedimentación gravitacional o removilización de biopelículas como conductores de retención o transporte de microbios5. Sin embargo, el estudio del transporte de bacterias a través de paisajes porosos también puede informarnos sobre las estrategias ecológicas que sustentan su éxito en estos entornos complejos. Sin embargo, esto requiere nuevos experimentos y modelos matemáticos que operan a nivel de una sola célula, población o comunidad microbiana.
Los ambientes porosos naturales, como los que se encuentran en la zona hiporreica de arroyos y ríos, son densamente colonizados por diversas comunidades de microbios formadores de biopelículas6. Las biopelículas forman estructuras que modifican el caudal y, por tanto, el transporte y dispersión de bacterias en la fase líquida7,,8. El transporte de bacterias a escala de poros depende de la disponibilidad de espacio restringido en la matriz porosa y la dispersión relacionada con la motilidad puede ser una manera eficaz de aumentar la aptitud individual a través de una menor competencia por recursos en áreas menos densamente pobladas. Por otro lado, las bacterias móviles también pueden llegar a regiones más aisladas de la matriz porosa y la exploración prolongada de estas áreas puede proporcionar oportunidades ecológicas a las poblaciones móviles10. A escalas espaciales más grandes, el crecimiento de la biopelícula desvía las trayectorias de flujo que también conducen a la obstrucción (parcial) de los poros y, por lo tanto, al establecimiento de condiciones de flujo aún más canalizadas y heterogéneas11. Esto tiene consecuencias para el suministro de nutrientes y la capacidad de dispersión, frecuencia y distancia. El flujo preferencial, por ejemplo, puede generar las llamadas “vías rápidas” y las bacterias móviles pueden alcanzar velocidades aún mayores que el flujo local a lo largo de estas pistas12. Esta es una manera eficaz de aumentar la exploración de nuevos hábitats.
Una variedad de herramientas sirven para el estudio del transporte de bacterias (y partículas) móviles y no móviles en medios porosos. Los modelos numéricos tienen grandes capacidades predictivas importantes para las aplicaciones, sin embargo, a menudo están limitados por supuestos inherentes4. Experimentos a escala de laboratorio13,14 combinados con el modelado de curvas de avance (BTC) han proporcionado información importante sobre la importancia de las propiedades de la superficie celular bacteriana para la eficiencia de pegado15. Típicamente, los BTC (es decir, las series de tiempos de concentración de partículas en un lugar fijo) se obtienen mediante liberaciones de velocidad constante y la medición de números de celda en la salida del dispositivo experimental. En este contexto, los BTC reflejan la dinámica de advección-dispersión de bacterias en la matriz porosa y pueden extenderse por un término de sumidero que tenga en cuenta la unión. Sin embargo, el modelado de BTC por sí solo no resuelve el papel de la organización espacial del sustrato poroso o biopelícula para los procesos de transporte. Se ha demostrado que otros observables macroscópicos como la dispersión o los perfiles de deposición proporcionan información importante sobre la distribución espacial o las partículas retenidas o las comunidades en crecimiento. Microfluidics es una tecnología que permite estudiar el transporte en medios porosos mediante la investigación de microscopía9,12,16, y excepto un trabajo reciente10, los sistemas experimentales suelen estar restringidos a una escala de sola longitud de resolución, es decir, la escala de poros o toda la escala de dispositivos fluidos.
Aquí, presentamos un conjunto de métodos combinados para estudiar el transporte de bacterias móviles y no móviles en paisajes porosos a diferentes escalas. Combinamos observaciones de transporte bacteriano a escala de poros con información a mayor escala, mediante análisis BTC. Los dispositivos microfluídicos construidos a partir de litografía blanda con polidimetilsiloxano (PDMS) son biocompetibles, resistentes a una gama de productos químicos, permiten replicabilidad a bajo costo y proporcionan una excelente transparencia óptica, así como baja autofluorescencia crítica para la observación microscópica. Los microfluídicos basados en PDMS se han utilizado previamente para estudiar el transporte de microbios en canales simples17 o en geometrías más complejas12. Sin embargo, los experimentos típicamente microfluídicos se centran en horizontes a corto plazo y la observación microscópica de epifluorescencia de células vivas se limita comúnmente a cepas modificadas genéticamente (por ejemplo, cepas etiquetadas por GFP). Aquí presentamos herramientas para estudiar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos basados en PDMS en combinación con microscopía y dispositivos más grandes fabricados a partir de poli(metil metacrilato) (PMMA, también conocido como plexiglás) en combinación con la citometría de flujo. PDMS y PMMA difieren en la permeabilidad al gas y las propiedades superficiales, proporcionando así oportunidades complementarias para estudiar el transporte bacteriano. Mientras que el dispositivo microfluídico proporciona un ambiente más controlado, el dispositivo más grande permite experimentos durante largos períodos de tiempo o el uso de comunidades bacterianas naturales. El recuento de microscopía a alta resolución temporal en un área dedicada se utiliza para obtener BTC en el dispositivo microfluídico basado en PDMS. Para obtener recuentos de células para el modelado BTC a partir del dispositivo basado en PMMA, introducimos un dispensador de líquido automatizado autoconstruido en combinación con la citometría de flujo. En esta configuración, las células pasan el dispositivo fluido y se dispensan consecutivamente en 96 placas de pozo. La resolución temporal está restringida por el volumen mínimo que se puede dispensar con precisión y, por lo tanto, el caudal medio a través del dispositivo fluido. El fijador en los pozos previene el crecimiento y facilita la tinción del ADN para la enumeración citométrica de flujo aguas abajo. Para prevenir el crecimiento bacteriano durante los experimentos de transporte utilizamos un medio mínimo (tampón de motilidad a) a) según el término.
Dado que los protocolos para la preparación de dispositivos fluidos a diferentes escalas están fácilmente disponibles, sólo introducimos brevemente las técnicas para producir tales dispositivos y más bien nos centramos en los procedimientos experimentales para grabar LOS BTC. Del mismo modo, existen varias rutinas para la enumeración citométrica de flujo de microbios y los usuarios requieren conocimientos expertos para interpretar los resultados obtenidos por citometría de flujo. Informamos del nuevo uso de dispositivos microfluídicos en combinación con imágenes microscópicas para registrar los BTC de células con etiquetas fluorescentes. A escala de poros, las velocidades y trayectorias locales se obtienen mediante el procesamiento de imágenes. Además, demostramos el uso de un dispositivo fluido basado en PMMA en combinación con el recuento citométrico de flujo para observar el transporte bacteriano de células móviles y no móviles en ambientes porosos colonizados por una biopelícula de flujo nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí sugerimos dos medios para estudiar el transporte de microbios a través de sistemas porosos a nivel de una sola célula y población. Si bien el estudio de los fenómenos de transporte utilizando el modelado BTC ha proporcionado información valiosa sobre la propagación de patógenos o contaminantes a escalas de ecosistemas, todavía existen dificultades para escalar de experimentos de laboratorio a condiciones de campo. Las herramientas descritas aquí permiten a los investigadores resolver experimentalmente las …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la ayuda de Antoine Wiedmer con la configuración del dispensador robótico y el guión dispenser.py.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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