Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions
Summary
Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.
Abstract
L’évaluation du profil global des topologies de chaîne d’ubiquitine dans un protéome est d’intérêt pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Le protocole décrit ici tire parti de la modification de la di-glycine (-GG) laissée après la digestion tryptique de l’ubiquitine incorporée dans une chaîne. En quantifiant ces peptides caractéristiques de la topologie, l’abondance relative de chaque topologie de la chaîne d’ubiquitine peut être déterminée. Les étapes nécessaires pour quantifier ces peptides par une expérience parallèle de surveillance des réactions sont signalées en tenant compte de la stabilisation des chaînes d’ubiquitine. La préparation des contrôles lourds, la lyse cellulaire, et la digestion sont décrites avec la configuration appropriée de spectromètre de masse et le flux de travail d’analyse de données. Un exemple de données avec des perturbations dans la topologie de l’ubiquitine est présenté, accompagné d’exemples de la façon dont l’optimisation du protocole peut affecter les résultats. En suivant les étapes décrites, un utilisateur sera en mesure d’effectuer une évaluation globale du paysage de topologie ubiquitine dans leur contexte biologique.
Introduction
La régulation étroite de la fonction et de la stabilité des protéines est d’une importance primordiale, car ils sont les principaux moteurs du contrôle phénotypique de la biologie. La fonction d’une protéine est construite à partir de deux composants : sa séquence intrinsèque de polypeptide et toutes les modifications posttranslationnelles (MPT). Divers M PTM chimiques ont été identifiés, y compris la glycosylation, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation1. En 1975, Goldstein et coll.2 ont identifié une petite protéine et l’ont nommée ubiquitine en raison de sa nature omniprésente. L’ubiquitine s’est trouvée importante dans la dégradation deprotéine 3. Cependant, depuis lors, il a été établi que la fonction de l’ubiquitine en tant que molécule de signalisation s’étend bien au-delà de la régulation de la stabilité des protéines. La signalisation d’ubiquitine est impliquée dans un large éventail d’autres fonctions biologiques, telles que la stabilisation de protéine, l’autophagie, le contrôle de cycle cellulaire, et le trafic deprotéine 4.
Alors que d’autres MNP sont généralement binaires (c.-à-d. que la protéine est modifiée ou non modifiée) pour un site donné, l’ubiquitine peut modifier une protéine à la fois comme monomère ou comme chaîne polymérique, l’ubiquitine ci-jointe étant elle-même ubiquitinée. En outre, cette chaîne de polyubiquitination peut se développer dans plusieurs topologies avec l’ubiquitination de l’ubiquitine précédente s’attachant à l’un des huit sites deliaison 5,6. L’ubiquitine est transférée par un processus enzymatique en plusieurs étapes (figure 1) où le C-terminus d’ubiquitine est relié à l’un de ses sept résidus de lysine (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou au terminal N de l’ubiquitine précédente (appelée ubiquitination M1 ou linéaire)5,6. Cette topologie de chaîne est la clé du sort de la protéine en cours de modification. Par exemple, la modification avec une chaîne liée au K48 ou au K11 entraîne la dégradation de la protéine modifiée au protéasome, tandis qu’une chaîne linéaire est nécessaire pour l’activation de la signalisation NF-kB. Ainsi, la répartition relative de ces topologies de chaîne est pertinente à une grande variété de questions biologiques.
L’utilisation de la spectrométrie de masse (SP) est particulièrement bénéfique pour l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine car elle ne dépend pas d’interactions basées sur les anticorps ou les affinités7,8, dont beaucoup ont une spécificité limitée et ne font pas de distinction entre les différents types de chaînes. Une autre possibilité de détection est d’utiliser des mutants ubiquitine génétiquement modifiés. Ici, une lysine spécifique est échangée contre de l’arginine, qui ne peut pas soutenir la modification par l’ubiquitine. L’absence de formation de chaîne d’ubiquitine sur la protéine de substrat est alors interprétée comme évidence pour une topologie spécifique9.
L’identification basée sur la SP des protéines ubiquitinées est basée sur le fait que le C-terminus d’ubiquitine contient un résidu d’arginine dans la position 74 qui est reconnu par la trypsine pendant la préparation protéolytique des échantillons pour l’analyse de la SP, séparant la double glycine du terminal C. Ce GlyGly (-GG) reste attaché au groupe ε-aminé du résidu de lysine de la protéine de substrat. Pour l’analyse de topologie d’ubiquitine, la modification se produit sur l’un des sept résidus de lysine de l’ubiquitine. Cela crée un ensemble de sept peptides clés qui transportent un résidu de lysine qui est modifié par GG, spécifique pour chacune des topologies (Figure 2). Par exemple, avec la topologie K06, la lysine à la position 6 sur la séquence des acides aminés sera protégée de la digestion tryptique avec une modification de -GG de 114 Da ajoutée à cette lysine.
L’identification de peptides prédéterminés spécifiques par la SP est appelée protéomique ciblée, ou plus précisément acquisition ciblée de peptides10. Deux méthodes ont été développées en fonction des performances du spectromètre de masse utilisé. Il s’agit d’une surveillance des réactions sélectionnée (GRS), également appelée surveillance des réactions multiples (MRM) et de la surveillance parallèle des réactions (PRM). SRM implique la sélection des transitions composées du précurseur m/z et de l’ion produit m/z. Inversement, PRM ne nécessite que le précurseur m/z. Après sélection, une analyse complète des ions du produit est effectuée. Cela a l’avantage qu’aucune sélection d’ions de produit appropriés pour la quantitation sur le spectromètre de masse spécifique n’est nécessaire avant lamesure 11. SRM et PRM peuvent, selon l’instrument, être programmés. La planification est la pratique consistant à attribuer une fenêtre de temps au cours de laquelle un ion particulier sera inclus pour analyse, car les peptides s’échappent à des moments de rétention définis à partir du système chromatographique. La réduction du nombre d’ions interrogés à un moment donné augmente la fréquence des interrogatoires des ions prévus à ce moment-là, améliorant ainsi l’exactitude des données.
En général, l’application de la protéomique ciblée pour la topologie de l’ubiquitine est la même que toute autre expérience protéomique ciblée. Cependant, deux différences clés sont importantes : premièrement, la stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en considération. Il existe de multiples enzymes déubiquitines puissantes (DUB) qui dégradent rapidement les chaînes lors de la lyse cellulaire. Les protéases spécifiques à l’ubiquitine se équipent en deux catégories, les thioesterases et les métalloproteases. La plupart des ubiquitine-hydrolases sont des thioesterases et portent un résidu de cystéine dans leur centre actif. En alkylating ce résidu de cystéine, ils peuvent être inactivés. En tant que tel, l’utilisation de tampons de stabilisation de l’ubiquitine contenant des agents alcalinateurs, comme l’éthylmaleimide N (NEM), et des produits chimiques très dénaturants, et de garder les échantillons réfrigérés est essentielle à une analyse réussie. Deuxièmement, contrairement à d’autres expériences ciblées, le choix du peptide est fixé. Dans une expérience ciblée typique, un peptide protéotypique peut être sélectionné pour une bonne performance chromatographique et ionisation. Pour certains peptides caractéristiques de la topologie tels que K48, ces propriétés sont bonnes, tandis que pour d’autres, elles sont moins souhaitables. Par exemple, la chromatographie K33 dans une configuration typique en phase inverse est pauvre en raison de la formation d’un profil d’élitution étiré, et les faibles propriétés d’ionisation du peptide K27 réduisent sa visibilité par MS12.
Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer l’évaluation de topologie d’ubiquitine d’un échantillon biologique par PRM. Des données d’exemple pour la procédure sont présentées utilisant une perturbation du protéasome utilisant le traitement inhibiteur de MG-132 dans plusieurs types différents de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de l’état d’ubiquitine dans un protéome est d’une importance croissante pour une grande variété de questions biologiques. La description de l’état d’ubiquitination d’un échantillon doit se concentrer non seulement sur le profil des protéines étant ubiquitinées, mais aussi sur la topologie d’une telle ubiquitination. L’évaluation de cette topologie par SP ciblée, telle que décrite ici, a un rôle à jouer dans un large éventail d’études biologiques.
I…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Céline Jeanty pour son aide dans la création de granulés cellulaires avec traitement du MG-132 tel que décrit dans les résultats représentatifs et Elise Mommaerts pour sa fourniture de granulés E. coli utilisés dans le protocole.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
