该协议描述了一种有效的电穿孔方法,用于转染四个不同胃肠道有机体实体,其质粒较大(范围为10 kB)。它可以在一天内执行,不需要大量准备或特殊的,成本密集型电穿孔缓冲器。
电穿孔是血浆膜电渗透对不同类型分子进行转染的常用方法。近年来,随着有机物作为原发性患者物质培养方法的日益应用,该3D培养系统中基因工程成分的有效转移方法也日益需要。特别是对于器官,基因操作的效率取决于成功的转染。因此,开发该协议是为了便利有机物的电穿孔,并证明其在不同实体中的通用功能。比较,人结肠直肠、胰腺癌、肝癌和胃癌有机体成功地用小质粒和大质粒电化。基于GFP编码向量,通过FACS测定转染效率。无需对电池进行大量制备,也无需使用成本高的特殊电穿孔缓冲液,且可在一天内执行该协议。
近年来,为各种正常和癌变组织开发了一种新的3D细胞培养系统,称为有机体。有机物在功能和形态上非常接近其起源组织。它们可以产生从不同的物种,很容易扩展,基因组稳定和基因可修改,这使得他们一个理想的模型系统的基因研究1,2,3。遗传工程技术,如CRISPR(集中定期间隔短音段重复)/Cas9系统支持不同的操作。克隆的选择可以通过定义的介质条件来实现,例如,通过WNT配体提取APC(腺瘤多波司大肠杆菌)敲除克隆4,5。或者,选择标记必须通过同源定向修复靶向量6,7来引入。由于往往需要引入多个质粒,有效的转染成为一个关键参数。此外,为了减少非特异性脱靶效应,Cas9内糖的瞬态表达是理想的8。
电穿孔是一种用DNA、RNA、蛋白质或其他大分子转染细胞的一种相对简单的方法。通过电脉冲,细胞膜变得更易渗透,并导致增加的接受量9。在先前公布的结肠器官电穿孔协议中,用猪巴GFP(绿色荧光蛋白)表达载体(7.4 kB)在四天程序10中达到30%的效率。开发以下方案,以促进癌症或健康器官的有效转染,其大质粒编码为单导RNA(sgRNA)和Cas9内分酶序列(例如px458作为载体,9.3 kb)。整个电穿孔过程可以在一天内进行,无需特殊的电穿孔缓冲液,并且不同胃肠道有机体(即 PDAC)、结肠直肠癌(CRC)、胆囊癌(CCC)和胃癌(GC)有机体之间至少具有可比效率。
该协议为高效、快速、简便地对不同有机体实体进行电穿孔提供了详细说明。除了来自PDAC、CRC、CCC和GC的肿瘤有机体外,它还成功地用于从健康组织衍生的有机体。该协议可在一天内执行。在公布的有机物转染方案中,整个过程历时四天,包括两天的准备,用不同类型的培养媒介10,21。在我们的协议中,不需要特殊的预处理。通过在电穿孔前用电穿孔缓冲液清洗,将介质的抗生素成分洗掉,并调整盐碱浓度,以实现最佳阻抗值。然而,成功的电穿孔应考虑一些关键方面:
细胞
在Fujii等人10的电穿孔协议中,建议将有机物分离到单个细胞中,并通过20μm细胞滤网过滤它们。在我们的手中消化到单个细胞会强烈地降低细胞的生存能力。正如Merenda等人21条所建议的那样,我们还将有机物分离到10-15个细胞的簇中,并且不能确定与单细胞分离相比效率降低。电穿孔后,分离白色泡沫是非常重要的一步,这样不会丢失任何附着的细胞。
对于2D细胞培养,已经表明,电穿孔超过10分钟至40分钟的再生时间可提高生存能力和转染效率,特别是大质粒22。在测试实验中,对有机体可以记录同样的情况,导致本协议中电穿孔后40分钟的孵育步骤。为了增加电穿孔的回收率,我们用Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632培养它们5至7天23。同样,补充糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂CHIR99021是为了帮助单个细胞恢复10。
设置
使用的电波器的优点之一是,阻抗可以在电穿孔之前测量,以实现最佳条件。根据制造商的说法,阻抗值应为 30-55 Ω。在我们手中,30-40 Ω 的阻抗值显示了最佳效率。在初步实验中,对孔隙脉冲的不同电压和脉冲长度值进行了变化,以找到效率与生存能力的最佳比例。总之,我们可以确认藤井等人10在本文描述的不同实体中描述的数值。
Dna
在初步实验中,对不同DNA量的影响进行了测试,每个样本的DNA含量高达45微克。检测出细胞毒性作用。转染效率以剂量依赖方式提高,饱和度>30 μg。因此,我们在最终协议中使用了每个样品30μg,但当然可以增加(例如,用于并行电穿孔)。此外,DNA的纯度和浓度似乎非常重要。浓度超过5μg/μL,显示了最佳的转染效率。
正如预期的那样,9.3 kB 质粒可以转染,其效率低于较小的 4.2 kB 质粒(参见图 4)。预计使用大于10 kB的质粒会进一步降低效率。对于未来的应用,测试小圆DNA作为载体可能很有趣,因为这些基因载体缺乏质粒的细菌骨干,这使得它们更小24。这应导致更高的转染效率。此外,对于基于CRISPR的有机物操作,直接电穿孔的sgRNA结合到Cas9作为核糖核蛋白(RNP)复合物可以是一个替代或添加25。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢朱利安·福格鲁、安-克里斯汀·梅内克和马克斯·海杜克的出色技术援助。资金由德国克雷布西尔夫(No 111350和70112925)、Sander Stiftung(No 2014.104.1)、赫克托·斯蒂夫通(No M65.2)和欧盟(ERC No 639050)提供。
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |