LINE-1 MethyleringAnalyse i mesenkymale stamceller behandlet med osteosarkom-afledte ekstracellulære vesikler
Summary
Beskrevet her er brugen af en methylering-specifik sonde forstærkning metode til at analysere methylering niveauer af LINE-1 elementer i mesenkymale stamceller behandlet med osteosarkom-afledte ekstracellulære vesikler. Ultracentrifugation, en populær procedure for adskillelse af ekstracellulære vesikler fra føtal kvægserum, er også påvist.
Abstract
Methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er en enkel og robust teknik, der kan bruges til at påvise relative forskelle i methyleringsniveauer af DNA-prøver. Det er ressourcestærke, kræver små mængder DNA, og tager omkring 4-5 h hands-on arbejde. I den præsenterede teknik, dna-prøver er først denatureret derefter hybridiseret til sonder, der er målrettet DNA på enten methylerede eller referencesteder som en kontrol. Hybridiseret DNA er opdelt i parallelle reaktioner, den ene gennemgår kun ligation og den anden gennemgår ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede GCGC sekvenser. De resulterende DNA-fragmenter forstærkes af PCR og adskilles af kapillær elektroforese. Methylerede GCGC-steder fordøjes ikke af HhaI og frembringer spidssignaler, mens umethylerede GCGC-steder fordøjes, og der genereres ingen spidssignaler. Sammenligning af kontrolnormaliserede toppe af fordøjede og ufordøjede versioner af hver prøve giver methylering doseringsforholdet af en DNA-prøve. Her anvendes MSPA til at opdage virkningerne af osteosarkomafledte ekstracellulære vesikler (EL’er) på methyleringsstatus for lange interspersed nukleare element-1 (LINE-1) i mesenkymale stamceller. LINE-1s er gentagne DNA-elementer, der typisk gennemgår hypomethylation i kræft og i denne egenskab kan tjene som en biomarkør. Ultracentrifugation anvendes også som en omkostningseffektiv metode til at adskille ekstracellulære vesikler fra biologiske væsker (dvs. ved tilberedning af ev-forarmet fosterserum [FBS] og isolering af elbiler fra osteosarkombetingede medier [differentialcentrifugation]). Til methyleringsanalyse er brugerdefinerede LINE-1-sonder designet til at målrette tre methyleringsanlæg i LINE-1-promotorsekvensen og syv kontrolsteder. Denne protokol viser brugen af MSPA til LIN-1-methyleringsanalyse og beskriver præparatet ev-forarmet FBS ved ultracentrifugation.
Introduction
DNA methylering er en større epigenetisk modifikation forekommer i humane celler. DNA-methylering henviser til sammenkædning af methylgrupper med cytosinrester i CpG dinucleotider. Sådanne dinucleotider findes normalt i klynger (CpG-øer) på 5 ‘ region af gener1. I normale celler findes de fleste af disse dinucleotider i en umethyleret tilstand, som tillader DNA transskription. I øvrigt, mange kræftformer er forbundet med hypermethylerede CpG øer og transskriptorisk hæmning2, især i tumor suppressor gener, som igen bidrager til forskellige kendetegnende for kræft3.
På den anden side er lange interspersed nukleare elementer-1 (LINE-1s eller L1s) gentagne, transposable DNA-elementer, der normalt har høje niveauer af methylering på CpG øer. Methylering af LINE-1 forhindrer translokation og hjælper med at opretholde genomintegriteten. I flere typer af kræft, LINE-1 er hypomethylated, resulterer i aktivering og efterfølgende retrogennemførelse-medieret kromosomale ustabilitet4. LINE-1 tegner sig for næsten 17 % af det menneskelige genom5, og dets methyleringsstatus kan tjene som indikator for det globale genomiske methyleringsniveau6. Global LINE-1 hypomethylation anses for at gå forud for overgangen af celler til en tumor fænotype7; derfor, det holder løfte som en potentiel markør for tidlig kræft debut.
I øjeblikket er der flere metoder til methylering analyse, herunder pyrosequencing, methylering-specifikke PCR, mikroarrays, og kromatin immunudfældning1. Brugen af næste generations sekventering har også gjort det muligt at indarbejde genombrede tilgange til påvisning af DNA-methylering. Mange af disse metoder er afhængige af bisulfit-behandlet DNA, hvor umethylerede cytosiner omdannes til uracil og methylerede cytosiner forbliver uændrede. Men, arbejder med bisulfit-behandlet DNA har flere faldgruber, såsom ufuldstændige konverteringer af umethylerede cytosiner til uracil, forudindtaget forstærkning af sekvenser, og sekventering fejl8.
I methyleringsspecifik sondeforstærkning (MSPA) er sonder, der består af to oligonucleotider, rettet mod DNA-sekvenser, der indeholder et restriktionssted (GCGC) for det methyleringsfølsomme restriktionsenzym HhaI9. Når sonderne hybridiserer til DNA, opdeles hver prøve i to sæt. Sonder i første sæt gennemgåligation, mens sonder i andet sæt gennemgå ligation efterfulgt af HhaI-medieret fordøjelse på umethylerede CGCG steder. Begge sæt prøver forstærkes derefter af PCR, og produkterne adskilles af kapillær elektroforese. Sonder på umethylerede steder fordøjes af HhaI og forstærkes ikke under PCR, hvilket resulterer i ingen spidsbelastningssignaler. Derimod er sonder på methylerede steder beskyttet mod fordøjelsen og forstærkes derfor under PCR og genererer efterfølgende spidssignaler10.
MSPA har flere fordele i forhold til alternative metoder. For det første kræver det en lav mængde DNA (50-100 ng) og er velegnet til analyse af DNA fra formalin-faste paraffin indlejrede prøver10. Det kræver ikke bisulfit-behandlet DNA; faktisk er det uegnet til DNA, der er ændret på denne måde. Mange prøver kan analyseres på samme tid, og MSPA sonder kan udformes således, at de er rettet mod flere gener eller sekvenser samtidig. Derudover sonderne er specifikke og følsomme for methyleret DNA som HhaI begrænsning site svarer til en sekvens, der er typisk for CpG øer10.
Denne undersøgelse undersøgte virkningerne af osteosarkom (OS)-afledte ekstracellulære vesikler (EL)på LINE-1 methylering i fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (AT-MSCs; Figur 1). Elbiler er nanoskala, membranbundne vesikler udskilles af de fleste celletyper. De bærer proteiner, lipider, mRNA, microRNA, og yderligere molekyler fra forældreceller11,12. El-producenter mægle intercellulære kommunikation og spiller vigtige roller i flere patofysiologiske forhold13,14. En nylig undersøgelse viste, at kræft-afledte elbiler kan overføre aktive LINE-1 til recipientceller15. Det er tidligere blevet rapporteret, at eldrevne køretøjer fra CELLElinjen HOS-143B kan ændre methyleringsstatus for LINE-1 i MSC ud over andre genetiske virkninger16.
Når der dyrkes celler til ev-isolation, er det vigtigt at anvende ev-forarmet føtal kvægserum [FBS] i vækstmediet, da FBS-afledte elbiler kan forstyrre eldrevne køretøjer fra andre kilder og hæmme resultaterne17,18. Ultracentrifugation er en af de mest almindelige metoder til udtømning af elbiler fra FBS. Det er en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv procedure sammenlignet med alternativer som ultrafiltrering og kommerciel EV-forarmet FBS19. Her viser protokollen også, hvordan man forbereder EV-forarmet FBS ved ultracentrifugation.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for ovennævnte teknikker, fra isolering af eldrevne køretøjer fra en OS-cellelinje til methyleringsanalysen af LINE-1 i OS-EV behandlede MSC ‘er (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse illustrerer, hvordan MSPA kan anvendes til at detektere og kvantificere methyleringsstatus for et bestemt genetisk element. LINE-1 var i fokus her, men sonderne kan designes til at målrette en række gener og sekvenser. Desuden er der en voksende liste af sonde blandinger til rådighed for forskellige applikationer. MSPA er en enkel og robust teknik til DNA-methyleringsanalyse, der ikke kræver bisulfitomdannelse10. Den komplette procedure fra prøveforberedelse til dataanalys…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af projektfinansiering fra University of Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Universitetshospital Statsmidler til sundhedsforskning på universitetsniveau (Y1014SUL05, TYH2016130), finsk-norsk medical foundation og Selma og Maja-Lisa Selander Fonden (Minerva Foundation). Vi takker Walter Pavicic for at levere den modificerede MSPA protokol og for relateret teknisk support. Vi er taknemmelige for Teemu Masalin (Helsinki Universitet) for at hjælpe os med videoproduktion.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Recherche en cancérologie. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
