Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

Snehadri Sinha; Bettina Mannerström; Riitta Seppänen-Kaijansinkko; Sippy Kaur

doi:10.3791/60705

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Article de méthode

Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

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DOI :

10.3791/60705

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1 février 2020

Snehadri Sinha^*¹^,² , Bettina Mannerström^*¹^,² , Riitta Seppänen-Kaijansinkko¹^,² , Sippy Kaur¹^,²

¹Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, ²Helsinki University Hospital

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Décrit ici est l'utilisation d'une méthode d'amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L'ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.

Résumé

L'amplification de sonde spécifique à la méthylation (MSPA) est une technique simple et robuste qui peut être utilisée pour détecter les différences relatives dans les niveaux de méthylation des échantillons d'ADN. Il est débrouillard, nécessite de petites quantités d'ADN, et prend environ 4 à 5 h de travail pratique. Dans la technique présentée, les échantillons d'ADN sont d'abord dénaturés puis hybridés en sondes qui ciblent l'ADN à des sites méthylés ou de référence comme un contrôle. L'ADN hybride est séparé en réactions parallèles, l'une subissant seulement la ligature et l'autre subissant la ligature suivie de la digestion HhaI-négociée aux séquences non méthylées de GCGC. Les fragments d'ADN qui en résultent sont amplifiés par PCR et séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sites GCGC méthylés ne sont pas digérés par HhaI et produisent des signaux de pointe, tandis que les sites GCGC non méthylés sont digérés et aucun signal de pointe n'est généré. La comparaison des pics normalisés de contrôle des versions digérées et non digérées de chaque échantillon fournit le rapport de dosage de méthylation d'un échantillon d'ADN. Ici, MSPA est utilisé pour détecter les effets des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome (VE) sur le statut de méthylation de l'élément nucléaire entrecoupé à long (LINE-1) dans les cellules souches mésenchymales. Les LINE-1 sont des éléments d'ADN répétitifs qui subissent généralement une hypométhylation dans le cancer et, à ce titre, peuvent servir de biomarqueur. L'ultracentrifugation est également utilisée comme méthode rentable pour séparer les vésicules extracellulaires des fluides biologiques (c.-à-d. lors de la préparation du sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques [FBS] et de l'isolation des VE à partir des médias conditionnés par l'ostéosarcome [centrifugation différentielle]). Pour l'analyse de méthylation, les sondes LINE-1 personnalisées sont conçues pour cibler trois sites de méthylation dans la séquence de promoteur LINE-1 et sept sites de contrôle. Ce protocole démontre l'utilisation de MSPA pour l'analyse de méthylation LINE-1 et décrit la préparation de LA SF APPAUVRIe par ultracentrifugation.

Introduction

La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique majeure qui se produit dans les cellules humaines. La méthylation de l'ADN fait référence au lien entre les groupes méthyliques et les résidus de cytosine dans les dinuccléotides du CpG. De tels dinucleotides se trouvent habituellement dans les grappes (îles CpG) à la région de 5' des gènes¹. Dans les cellules normales, la plupart de ces dinucléotides existent dans un état non méthylé, ce qui permet la transcription de l'ADN. Incidemment, de nombreux cancers sont associés à des îles cpG hyperméthylées et au silençage transcriptomique², en particulier dans les gène....