LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden
Summary
Beschrieben wird hier die Verwendung einer methylierungsspezifischen Sondenverstärkungsmethode zur Analyse der Methylierungvon LINE-1-Elementen in mesenchymalen Stammzellen, die mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden. Ultrazentrifugation, ein beliebtes Verfahren zur Trennung extrazellulärer Vesikel vom fetalen Rinderserum, wird ebenfalls demonstriert.
Abstract
Die Methylierungsspezifische Sondenverstärkung (MSPA) ist eine einfache und robuste Technik, mit der relative Unterschiede in den Methylierungswerten von DNA-Proben erkannt werden können. Es ist einfallsreich, erfordert kleine Mengen an DNA und dauert etwa 4-5 h hands-on Arbeit. In der vorgestellten Technik werden DNA-Proben zunächst denaturiert und dann zu Sonden hybridisiert, die entweder auf methylierte oder Referenzstellen als Kontrolle abzielen. Hybridisierte DNA wird in parallele Reaktionen getrennt, eine unterzieht sich nur ligation und die andere wird ligation, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung in nicht methylierten GCGC-Sequenzen. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch PCR verstärkt und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Methylierte GCGC-Standorte werden von HhaI nicht verdaut und erzeugen Spitzensignale, während nicht methylierte GCGC-Standorte verdaut werden und keine Spitzensignale erzeugt werden. Der Vergleich der kontrollnormalisierten Spitzen verdauter und unverdauter Versionen jeder Probe ergibt das Methylierungs-Dosierungsverhältnis einer DNA-Probe. Hier wird MSPA verwendet, um die Auswirkungen von Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf den Methylierungsstatus von lang durchsetzten Kernelement-1 (LINE-1) in mesenchymalen Stammzellen zu erkennen. LINE-1 sind repetitive DNA-Elemente, die typischerweise bei Krebs hypomethyliert werden und in dieser Eigenschaft als Biomarker dienen können. Ultrazentrifugation wird auch als kostengünstige Methode verwendet, um extrazelluläre Vesikel von biologischen Flüssigkeiten zu trennen (d. h. bei der Herstellung von EV-erschöpftem fetalem Rinderserum [FBS] und der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Osteosarkom-konditionierten Medien [Differentialzentrifugation]). Für die Methylierungsanalyse sind benutzerdefinierte LINE-1-Sonden für drei Methylierungsstandorte in der LINE-1-Promotorsequenz und sieben Kontrollstellen ausgelegt. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MSPA für die LINE-1-Methylierungsanalyse und beschreibt die Herstellung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation.
Introduction
DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die in menschlichen Zellen auftritt. DNA-Methylierung bezieht sich auf die Verknüpfung von Methylgruppen mit Zytosinrückständen in CpG-Dinukleotiden. Solche Dinukleotide finden sich in der Regel in Clustern (CpG-Inseln) in der 5′ Region der Gene1. In normalen Zellen existieren die meisten dieser Dinukleotide in einem unmethylierten Zustand, der eine DNA-Transkription ermöglicht. Übrigens sind viele Krebsarten mit hypermethylierten CpG-Inseln und transkriptomischer Silencing2verbunden, insbesondere in Tumorsuppressor-Genen, die wiederum zu verschiedenen Merkmalen von Krebs beitragen3.
Andererseits sind lange durchsetzte Kernelemente-1 (LINE-1s oder L1s) repetitive, transponierbare DNA-Elemente, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad auf CpG-Inseln aufweisen. Die Methylierung von LINE-1 verhindert die Translokation und trägt zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Bei mehreren Krebsarten wird LINE-1 hypomethyliert, was zu einer Aktivierung und anschließender retrotranspositionierter chromosomaler Instabilität4führt. LINE-1 macht fast 17% des menschlichen Genoms5aus, und sein Methylierungsstatus kann als Indikator für die globale genomische Methylierung6dienen. Globale LINE-1-Hypomethylierung gilt als vor dem Übergang von Zellen zu einem Tumor-Phänotyp7; daher verspricht sie als potenzieller Marker für den frühen Krebsbeginn.
Derzeit gibt es mehrere Methoden für die Methylierungsanalyse, einschließlich Pyrosequencing, methylierungsspezifischer PCR, Mikroarrays und Chromatin-Immunpräzipitation1. Die Verwendung der Sequenzierung der nächsten Generation hat es auch ermöglicht, genomweite Ansätze zum Nachweis der DNA-Methylierung zu integrieren. Viele dieser Methoden basieren auf bisulfitbehandelter DNA, bei der unmethylierte Zytosine in Uracil umgewandelt werden und methylierte Zytosine unverändert bleiben. Die Arbeit mit bisulfitbehandelter DNA hat jedoch mehrere Fallstricke, wie unvollständige Umwandlungen von nicht methylierten Zytosinen in Uracil, voreingenommene Amplifikation von Sequenzen und Sequenzierungsfehler8.
Bei der methylierungsspezifischen Sondenverstärkung (MSPA) zielen Sonden aus zwei Oligonukleotiden auf DNA-Sequenzen ab, die eine Restriktionsstelle (GCGC) für das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym HhaI9enthalten. Nachdem die Sonden mit der DNA hybridisiert wurden, wird jede Probe in zwei Sätze unterteilt. Sonden im ersten Satz werden einer Ligation unterzogen, während Sonden im zweiten Satz einer Ligation unterzogen werden, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung an unmethylierten CGCG-Standorten. Beide Probensätze werden dann durch PCR verstärkt, und die Produkte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt. Sonden an unmethylierten Standorten werden von HhaI verdaut und während der PCR nicht verstärkt, was zu keinen Spitzensignalen führt. Im Gegensatz dazu sind Sonden an methylierten Standorten vor der Verdauung geschützt und werden daher während der PCR verstärkt, wodurch anschließend Spitzensignale10erzeugt werden.
MSPA hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Erstens benötigt es eine geringe Menge an DNA (50–100 ng) und eignet sich gut für die Analyse der DNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben10. Es erfordert keine Bisulfit-behandelte DNA; in der Tat, es ist ungeeignet für DNA, die auf diese Weise modifiziert wird. Viele Proben können gleichzeitig analysiert werden, und MSPA-Sonden können so konzipiert werden, dass sie mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig zielen. Darüber hinaus sind die Sonden spezifisch und empfindlich für methylierte DNA, da die HhaI Restriktionsstelle einer Sequenz entspricht, die typisch für CpG-Inseln10ist.
Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Osteosarkom (OS)-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf die LINE-1-Methylierung in fettgewebeabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AT-MSCs; Abbildung 1). Elektrofahrzeuge sind nanoskalige, membrangebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen abgesondert werden. Sie tragen Proteine, Lipide, mRNA, microRNA und zusätzliche Moleküle aus den Elternzellen11,12. EVs vermitteln interzelluläre Kommunikation und spielen eine wichtige Rolle bei mehreren pathophysiologischen Bedingungen13,14. Eine aktuelle Studie zeigte, dass krebsverlesene Elektrofahrzeuge aktive S.1-V1 auf Empfängerzellen übertragen können15. Es wurde bereits berichtet, dass Elektrofahrzeuge aus der HOS-143B-Zelllinie den Methylierungsstatus von LINE-1 in MSCs verändern können, zusätzlich zu anderen genetischen Effekten16.
Beim Anbau von Zellen zur EV-Isolierung ist es wichtig, EV-dezimiertes fetales Rinderserum [FBS] im Wachstumsmedium zu verwenden, da FBS-abgeleitete Elektrofahrzeuge EVs aus anderen Quellen stören und die Ergebnisse17,18behindern können. Ultrazentrifugation ist eine der häufigsten Methoden zur Erschöpfung von Elektrofahrzeugen von FBS. Es ist ein relativ einfaches und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zu Alternativen wieUltrafiltration und kommerzielle EV-erschöpftfb19 . Hier zeigt das Protokoll auch, wie EV-erschöpfte FBS durch Ultrazentrifugation vorbereitet werden.
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die oben genannten Techniken vor, von der Isolierung von Elektrofahrzeugen von einer OS-Zelllinie bis zur Methylierungsanalyse von LINE-1 in OS-EV behandelten MSCs (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie zeigt, wie MSPA verwendet werden kann, um den Methylierungsstatus eines bestimmten genetischen Elements zu erkennen und zu quantifizieren. LINE-1 stand hier im Mittelpunkt, aber die Sonden können so konzipiert werden, dass sie auf eine Reihe von Genen und Sequenzen abzielen. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von Sondenmischungen, die für verschiedene Anwendungen verfügbar sind. MSPA ist eine einfache und robuste Technik für die DNA-Methylierungsanalyse, die keine Bisulfitumwandlung<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Projektförderung der Universität Helsinki (WBS490302, WBS73714112) gefördert. Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Wir danken Walter Pavicic für die Bereitstellung des modifizierten MSPA-Protokolls und für den damit verbundenen technischen Support. Wir danken Teemu Masalin (Universität Helsinki) für die Unterstützung bei der Videoproduktion.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
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