LINE-1 Mesenkymala stamceller behandlade med osteosarkom-härledda extracellulära blåsor
Summary
Beskrivs här är användningen av en metylering-specifik sond amplifiering metod för att analysera metylering nivåer av LINE-1 element i mesenkymala stamceller behandlas med osteosarkom-härledda extracellulära blåsor. Ultracentrifugering, ett populärt förfarande för att separera extracellulära blåsor från fetala bovin serum, visas också.
Abstract
Metylering-specifik sond förstärkning (MSPA) är en enkel och robust teknik som kan användas för att upptäcka relativa skillnader i metylering nivåer av DNA-prover. Det är påhittig, kräver små mängder DNA, och tar cirka 4-5 h praktiskt arbete. I den presenterade tekniken, DNA-prover först denatureras sedan hybridiseras till sonder som riktar DNA på antingen metylerade eller referensplatser som en kontroll. Hybridiserat DNA är uppdelad i parallella reaktioner, en genomgår endast ligering och den andra genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade GCGC-sekvenser. De resulterande DNA-fragmentförstärks av PCR och separeras genom kapillärelektrofores. Metylerade GCGC platser inte smältav HhaI och producera toppsignaler, medan ometylerade GCGC platser smälts och inga toppsignaler genereras. Jämföra kontroll-normaliserade toppar av smälta och osmälta versioner av varje prov ger metylering doseringförhållandet av ett DNA-prov. Här används MSPA för att upptäcka effekterna av osteosarkom-härledda extracellulära blåsor (EVs) på metylering status långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1) i mesenkymala stamceller. LINE-1s är repetitiva DNA-faktorer som vanligtvis genomgår hypometylering i cancer och, i denna egenskap, kan fungera som en biomarkör. Ultracentrifugation används också som en kostnadseffektiv metod för att separera extracellulära blåsor från biologiska vätskor (dvs. vid beredning av EV-utarmat fetalt nötkreaturserum [FBS] och isolerae nde organ från osteosarkom konditionerade medier [differentiell centrifugering]). För metyleringanalys är anpassade LINE-1-sonder utformade för att rikta in sig på tre metylationsplatser i LINE-1-promotorn och sju kontrollplatser. Detta protokoll visar användningen av MSPA för LINE-1 metylering analys och beskriver beredningen av EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.
Introduction
DNA-metylering är en viktig epigenetisk modifiering som förekommer i mänskliga celler. DNA-metylering avser kopplingen mellan metylgrupper till cytosinrester i CpG-dinukleotids. Sådana dinucleotides finns vanligtvis i kluster (CpG öar) i 5 region av gener1. I normala celler finns de flesta av dessa dinukleotider i ett ometylat tillstånd, vilket möjliggör DNA-transkription. Förresten, många cancerformer är associerade med hypermetylerade CpG öar och transkriptomiska ljuddämpning2, särskilt i tumör suppressor gener, vilket i sin tur bidrar till olika kännetecken för cancer3.
Å andra sidan är långa interspersed nukleära element-1 (LINE-1s eller L1s) repetitiva, transposable DNA-element som normalt har höga halter av metylering på CpG öar. Metylering av LINE-1 förhindrar flyttning och hjälper till att upprätthålla genomintegritet. I flera typer av cancer är LINE-1 hypometylerad, vilket resulterar i aktivering och efterföljande retroinförlivande-medierad kromosomal instabilitet4. LINE-1 står för nästan 17% av det mänskligagenomet 5, och dess metylering status kan fungera som en indikator på globala genomiska metylering nivåer6. Global LINE-1 hypomethylation anses föregå övergången av celler till en tumör fenotyp7; Därför håller det löfte som en potentiell markör för tidig cancer debut.
För närvarande finns det flera metoder för metylering analys, inklusive pyrosequencing, metylering-specifika PCR, mikroarrayer, och kromatin immunoprecipitation1. Användningen av nästa generations sekvensering har också gjort det möjligt att införliva genomomfattande metoder för påvisande av DNA-metylering. Många av dessa metoder är beroende av bisulfit-behandlade DNA, där ometylerade cytosiner omvandlas till uracil och metylerade cytosiner förblir oförändrade. Arbeta med bisulfit-behandlat DNA har dock flera fallgropar, såsom ofullständiga omvandlingar av ometylerade cytosiner till uracil, partisk förstärkning av sekvenser och sekvensering fel8.
I metylering-specifik sondamplifiering (MSPA), sonder som består av två oligonukleotider mål DNA-sekvenser som innehåller en begränsning siten (GCGC) för metylering-känsliga begränsningsenzym HhaI9. Efter sonderna hybridisera till DNA, varje prov är uppdelad i två uppsättningar. Sonder i den första uppsättningen genomgår ligering, medan sonder i den andra uppsättningen genomgår ligering följt av HhaI-medierad matsmältning vid ometylerade CGCG platser. Båda uppsättningarna av prover förstärks sedan av PCR, och produkterna separeras med kapillärelektrofores. Sonder på ometylerade platser smälts av HhaI och förstärks inte under PCR, vilket resulterar i några toppsignaler. Däremot är sonder på metylerade platser skyddade mot matsmältningoch förstärks därför under PCR, därefter genererar toppsignaler10.
MSPA har flera fördelar jämfört med alternativa metoder. För det första kräver det en låg mängd DNA (50–100 ng) och är väl lämpad för analys av DNA från formalinfixat paraffininbäddade prover10. Det kräver inte bisulfit-behandlat DNA; I själva verket är det olämpligt för DNA som ändras på detta sätt. Många prover kan analyseras samtidigt, och MSPA-sonder kan utformas så att de riktar sig till flera gener eller sekvenser samtidigt. Dessutom är sonderna specifika och känsliga för metylerad DNA eftersom HhaI-begränsningsplatsen motsvarar en sekvens som är typisk för CpG-öarna10.
Denna studie undersökte effekterna av osteosarkom (OS)-härledda extracellulära blåsor (EVs) på LINE-1 metylering i fettvävnad-härledda mesenkymala stamceller (AT-MSCs; figur 1). EVs är nanoskala, membran-bundna blåsor utsöndras av de flesta celltyper. De bär proteiner, lipider, mRNA, microRNA och ytterligare molekyler från moderceller11,12. EVs förmedlar intercellulär kommunikation och spelar viktiga roller i flera patofysiologiska förhållanden13,14. En färsk studie visade att cancer-härledda EVs kan överföra aktiv LINE-1 till mottagare celler15. Det har tidigare rapporterats att EVs från HOS-143B cellinjen kan ändra metylering status LINE-1 i MSCs, utöver andra genetiska effekter16.
När celler odlas för EV isolering, är det viktigt att använda EV-utarmat fetalt nötkreatur serum [FBS] i tillväxtmediet, eftersom FBS-härledda EVs kan störa EVs från andra källor och hämma resultaten17,18. Ultracentrifugering är en av de vanligaste metoderna för utarmning av EVs från FBS. Det är ett relativt enkelt och kostnadseffektivt förfarande jämfört med alternativ som ultrafiltrering och kommersiella EV-utarmat FBS19. Här visar protokollet också hur man förbereder EV-utarmat FBS genom ultracentrifugering.
Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för ovannämnda tekniker, från isolering av EVs från en OS-cellinje till metylering analys av LINE-1 i OS-EV behandlade MSCs(figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie visar hur MSPA kan användas för att upptäcka och kvantifiera metyleringstatus en specifik genetisk faktor. LINE-1 var fokus här, men sonderna kan utformas för att rikta en rad gener och sekvenser. Dessutom finns det en växande lista över sondblandningar tillgängliga för olika applikationer. MSPA är en enkel och robust teknik för DNA-metyleringanalys som inte kräver bisulfitkonvertering10. Den fullständiga proceduren från provförberedelse till dataanalys tar cirka 2 daga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Helsingfors universitet projektfinansiering (WBS490302, WBS73714112) Helsingfors universitetssjukhus Statlig finansiering för universitetsforskning på universitetsnivå (Y1014SUL05, TYH2016130), Finsk-norska medicinska stiftelsen, och Selma och Maja-Lisa Selander-fonden (Minervastiftelsen). Vi tackar Walter Pavicic för att ha lämnat det ändrade MSPA-protokollet och för relaterad teknisk support. Vi är tacksamma mot Teemu Masalin (Helsingfors universitet) för att hjälpa oss med videoproduktion.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Recherche en cancérologie. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
