Osteosarkom Türetilmiş Ekstrasellüler Ile Tedavi Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerde LINE-1 Metilasyon Analizi
Summary
Burada açıklanan osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler ile tedavi mezenkimal kök hücrelerde LINE-1 elemanlarının METilasyon düzeylerini analiz etmek için bir metilasyon özgü prob amplifikasyon yönteminin kullanımıdır. Ekstrasellüler vezikülleri fetal sığır serumundan ayırmak için popüler bir prosedür olan ultrasantrifüj de gösterilmiştir.
Abstract
Metilasyona özgü prob amplifikasyon (MSPA), DNA örneklerinin metilasyon düzeylerindeki göreceli farklılıkları tespit etmek için kullanılabilen basit ve sağlam bir tekniktir. Beceriklidir, az miktarda DNA gerektirir ve yaklaşık 4-5 saat pratik çalışma gerektirir. Sunulan teknikte, DNA örnekleri önce denatüre edilir, sonra da dna’yı kontrol olarak metillenmiş veya referans alanlarda hedefleyen problarla melezlenir. Melezleştirilmiş DNA paralel reaksiyonlara ayrılır, biri sadece ligasyon, diğeri ise metillenmemiş GCGC dizilerinde HhaI aracılı sindirim inanılması ile ligasyondan geçilir. Ortaya çıkan DNA parçaları PCR ile yükseltilir ve kapiller elektroforez ile ayrılır. Metillenmiş GCGC siteleri HhaI tarafından sindirilmez ve pik sinyaller üretirken, metillenmemiş GCGC siteleri sindirilir ve pik sinyalleri üretilmez. Her bir numunenin sindirilmiş ve sindirilmemiş versiyonlarının kontrol-normalleştirilmiş zirvelerinin karşılaştırılması, bir DNA örneğinin metilasyon dozaj oranını sağlar. Burada, MSPA mezenkimal kök hücrelerde uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) metilasyon durumu osteosarkom kaynaklı ekstrasellüler (EVs) etkilerini tespit etmek için kullanılır. LINE-1’ler genellikle kanserde hipometilasyon geçiren tekrarlayan DNA elementleridir ve bu kapasitede biyomarker görevi görebilir. Ultracentrifugation ayrıca ekstrasellüler vezikülleri biyolojik sıvılardan ayırmak için uygun maliyetli bir yöntem olarak da kullanılmaktadır (örneğin, EV-tükenmiş fetal sığır serumu hazırlanırken [FBS] ve osteosarkom şartlı ortamdan eVs izole [diferansiyel santrifüj]). Metilasyon analizi için, özel LINE-1 probları LINE-1 organizatör dizisindeüç metilasyon sahasını ve yedi kontrol sahasını hedeflemek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol LINE-1 metilasyon analizi için MSPA kullanımını gösterir ve ultracentrifugation tarafından EV-tükenmiş FBS hazırlanması açıklar.
Introduction
DNA metilasyon insan hücrelerinde meydana gelen önemli bir epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyon CpG dinükleotidlerde sitozin kalıntıları metil gruplarının bağlantı anlamına gelir. Bu tür dinükleotidler genellikle kümelerde (CpG adaları) genlerin 5′ bölgesinde bulunur1. Normal hücrelerde, bu dinükleotidlerin çoğu metillenmemiş bir durumda bulunur, bu da DNA transkripsiyonuna izin verir. Bu arada, birçok kanser hipermethylated CpG adaları ve transkripsiyon ile ilişkili2, özellikle tümör baskılayıcı genlerde, hangi sırayla kanser çeşitli işaretleri katkıda3.
Öte yandan, uzun serpiştirilmiş nükleer elementler-1 (LINE-1s veya L1s) normalde CpG adalarında yüksek metilasyon seviyelerine sahip tekrarlayan, transposable DNA elemanlarıdır. LINE-1’in metilasyonunu önler ve genom bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Çeşitli kanser türlerinde LINE-1 hipometilatlanır, aktivasyon ve sonraki retrotranspozisyon aracılı kromozomal instabilite ile sonuçlanır4. LINE-1 insan genomunun yaklaşık% 17 için hesaplar5, ve metilasyon durumu küresel genomik metilasyon düzeyleri nin bir göstergesi olarak hizmet verebilir6. Global LINE-1 hipometilasyonunun hücrelerin tümör fenotip7’yegeçişinden önce olduğu kabul edilir; bu nedenle, erken kanser başlangıcı için potansiyel bir belirteç olarak umut tutar.
Şu anda, pyrosequencing, metilasyona özgü PCR, mikrodiziler ve kromatin immünopresipitasyon1dahil olmak üzere metilasyon analizi için çeşitli yöntemler vardır. Yeni nesil sıralamanın kullanımı, DNA metilasyonunun saptanması için genom çapında yaklaşımların dahil edilmesine de mümkün kılmıştır. Bu yöntemlerin çoğu, metillenmemiş sitozinlerin urasil’e dönüştürüldüğü ve metillenmiş sitozinlerin değişmediği bisülfit le tedavi edilmiş DNA’ya dayanır. Ancak, bisülfit le tedavi DNA ile çalışan urasil metillenmemiş sitozinlerin eksik dönüşümleri gibi çeşitli tuzaklar vardır, dizilerin önyargılı amplifikasyon, ve sıralama hataları8.
Metilasyona özgü prob amplifikasyonda (MSPA), iki oligonükleotidden oluşan problar metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi HhaI9için bir restriksiyon alanı (GCGC) içeren DNA dizilerini hedef alır. Sondalar DNA ile melezleştikten sonra, her örnek iki kümeye ayrılır. İlk sette problar ligasyondan geçerken, ikinci sette problar ligasyondan geçerken, metillenmemiş CGCG bölgelerinde HhaI aracılı sindirim emdirilir. Her iki numune seti de PCR ile güçlenir ve ürünler kılcal elektroforez ile ayrılır. Metillenmemiş bölgelerdeki problar HhaI tarafından sindirilir ve PCR sırasında yükseltilmez, bu da tepe sinyalleri ne olmaz. Buna karşılık, metillenmiş bölgelerdeki problar sindirime karşı korunur ve bu nedenle PCR sırasında yükseltilir ve daha sonra tepe sinyalleri10üretir.
MSPA’nın alternatif yöntemlere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, düşük miktarda DNA gerektirir (50-100 ng) ve formalin-sabit parafin gömülü örneklerden DNA analizi için uygundur10. Bu bisülfit tedavi DNA gerektirmez; aslında, bu şekilde modifiye DNA için uygun değildir. Birçok örnek aynı anda analiz edilebilir ve MSPA sondaları aynı anda birden fazla geni veya diziyi hedeflenecek şekilde tasarlanabilir. Ayrıca, hhaI kısıtlama alanı CpG adaları10tipik bir dizi karşılık gelir gibi problar metillenmiş DNA için özel ve duyarlıdır.
Bu çalışmada osteosarkom (OS) türetilmiş ekstrasellüler (EVs) line-1 metilasyon üzerinde yağ dokusu türetilmiş mezenkimal kök hücrelerde (AT-MSCs) etkileri araştırıldı; Şekil 1). EVs çoğu hücre türleri tarafından salgılanan nano ölçekli, membran bağlı veziküller vardır. Onlar proteinler, lipidler, mRNA, mikroRNA ve ana hücrelerden ek moleküller taşırlar11,12. EVs hücreiçi iletişim aracılık ve çeşitli patofizyolojik koşullarda önemli roller oynamaktadır13,14. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kanser kaynaklı EV’lerin aktif LINE-1’i alıcı hücrelere aktarabileceğini gösterdi15. Daha önce HOS-143B hücre hattından EVs DIĞER genetik etkilere ek olarak, MSCs LINE-1 metilasyon durumunu değiştirebilirsiniz bildirilmiştir16.
EV izolasyonu için büyüyen hücreler, FBS kaynaklı EVs diğer kaynaklardan EVs müdahale ve sonuçları engelleyebilir beri, büyüme orta EV tükenmiş fetal sığır serumu [FBS] kullanmak önemlidir17,18. Ultracentrifugation FBS evleri tüketmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bu ultrafiltrasyon ve ticari EV tükenmiş FBS19gibi alternatiflerile karşılaştırıldığında nispeten basit ve uygun maliyetli bir işlemdir. Burada protokol, EV’in tüketmiş FBS’sinin ultrasantrifikasyon la nasıl hazırlanacağını da göstermektedir.
Bu makalede, os-ev tedavi MSCs LINE-1 metilasyon analizi için bir işletim sistemi hücre hattından EVs izolasyonu, yukarıda belirtilen teknikler için ayrıntılı bir protokol sunar(Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, MSPA’nın belirli bir genetik elementin metilasyon durumunu tespit etmek ve ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. LINE-1 burada odak noktası oldu, ama sondalar genler ve diziler bir dizi hedef için tasarlanmış olabilir. Ayrıca, farklı uygulamalar için kullanılabilir prob karışımları büyüyen bir liste vardır. MSPA, bisülfit dönüşüm gerektirmeyen DNA metilasyon analizi için basit ve sağlam bir tekniktir10. Örnek hazırlamadan veri analizin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Helsinki Üniversitesi proje finansmanı (WBS490302, WBS73714112) Helsinki Üniversitesi Hastanesi Devlet üniversite düzeyinde sağlık araştırmaları için fon (Y1014SUL05, TYH2016130), Finlandiya-Norveç Tıp Vakfı ve Selma ve Maja-Lisa Selander Fonu (Minerva Vakfı). Walter Paviciç’e değiştirilmiş MSPA protokolünü sağladığı ve ilgili teknik destek için teşekkür ederiz. Teemu Masalin’e (Helsinki Üniversitesi) video prodüksiyonunda bize yardımcı olduğu için minnettarız.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Recherche en cancérologie. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
