Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie
Summary
We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.
Abstract
Gehumaniseerde muizen bieden een geavanceerd platform om menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) virologie te bestuderen en antivirale geneesmiddelen te testen. Dit protocol beschrijft de oprichting van een menselijk immuunsysteem bij volwassen NOG muizen. Hier leggen we alle praktische stappen uit van isolatie van navelstrengbloed afkomstig van menselijke CD34+ cellen en hun daaropvolgende intraveneuze transplantatie in de muizen, tot de manipulatie van het model door hiv-infectie, combinatie antiretrovirale therapie ( cART) en bloedafname. Ongeveer 75.000 hCD34+ cellen worden intraveneus geïnjecteerd in de muizen en het niveau van menselijk chimerisme, ook bekend als humanisering, in het perifere bloed wordt in de lengterichting geschat voor maanden door flow cytometrie. Een totaal van 75.000 hCD34+ cellen levert 20%–50% menselijke CD45+ cellen op in het perifere bloed. De muizen zijn gevoelig voor intravaginale infectie met HIV en bloed kan eenmaal per week worden bemonsterd voor analyse, en twee maal per maand voor langere perioden. Dit protocol beschrijft een test voor kwantificering van plasma virale belasting met behulp van druppel digitale PCR (ddPCR). We laten zien hoe de muizen effectief kunnen worden behandeld met een standaard-of-care cART-regime in het dieet. De levering van cART in de vorm van gewone muis chow is een aanzienlijke verfijning van het experimentele model. Dit model kan worden gebruikt voor preklinische analyse van zowel systemische als actuele pre-exposure profylaxeverbindingen en voor het testen van nieuwe behandelingen en HIV-genezingsstrategieën.
Introduction
Menselijk immunodeficiëntievirus (HIV) is een chronische infectie met meer dan 37 miljoen geïnfecteerde personen wereldwijd1. Combinatie antivirale therapie (cART) is een levensreddende therapie, maar een remedie is nog steeds gerechtvaardigd. Er is dus behoefte aan diermodellen die het menselijk immuunsysteem en de reacties ervan weerspiegelen om verder onderzoek naar HIV te vergemakkelijken. Meerdere soorten gehumaniseerde muizen die cel- en weefselengraftment kunnen ondersteunen, zijn ontwikkeld door menselijke cellen te transplanteren in ernstig immunodeficiënte muizen2. Dergelijke gehumaniseerde muizen zijn gevoelig voor HIV-infectie en bieden een belangrijk alternatief voor niet-menselijke primaat simian immunodeficiëntie virus modellen, omdat ze goedkoper en eenvoudiger te gebruiken dan niet-menselijke primaten. Gehumaniseerde muizen hebben onderzoek naar hiv-virale overdracht, pathogenese, preventie en behandeling3,4,5,6,7,8,9,10,11vergemakkelijkt.
We presenteren een flexibel gehumaniseerd modelsysteem voor HIV-onderzoek ontwikkeld door het transplanteren van navelstrengbloed afkomstige menselijke stamcellen in muizen van de NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) achtergrond. Naast het feit dat van niet-foetale oorsprong, de praktische bio-engineering van deze muizen is minder technisch veeleisend in vergelijking met de microchirurgische procedures die betrokken zijn bij de transplantatie van de bloed-lever-thymus (BLT) constructie.
We laten zien hoe je hiv-infectie vast te stellen door middel van intravaginale transmissie en hoe het plasma virale belasting te controleren met een gevoelige druppel digitale PCR (ddPCR) gebaseerde setup. Vervolgens beschrijven we de oprichting van standaard cART gegeven als onderdeel van de dagelijkse muis dieet. Het doel van deze gecombineerde methoden is om stress voor de dieren te verminderen en grootschalige experimenten te vergemakkelijken waarbij de tijd die wordt besteed aan het hanteren van elk dier beperkt is12.
Bij mensen veroorzaakt een CCR5Δ32/wt of CCR5Δ32/ Δ32 genotype een verminderde gevoeligheid voor hiv-infectie met zender/stichtersvirussen13, en sommige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij bio-engineering gehumaniseerde muizen met stamcellen voor hiv-studies. Dit geldt vooral in onze regio omdat natuurlijk voorkomende varianten in het CCR5-gen, met name Δ32-deleties, vaker voorkomen in Scandinavische en Baltische inheemse populaties in vergelijking met de rest van de wereld14,15. Zo bevat ons protocol een eenvoudige, hoge doorvoertest voor het screenen van donorhematopoietische stamcellen voor CCR5-varianten voorafgaand aan transplantatie.
Voor de intravaginale blootstelling kozen we de zender / oprichter R5 virus RHPA4259, geïsoleerd van een vrouw in een vroeg stadium van infectie die intravaginale besmet was16. We stelden de muizen bloot aan een virale dosis die voldoende was om een succesvolle overdracht in de meerderheid van de muizen op te leveren, maar onder een 100% transmissiesnelheid. Het kiezen van een dergelijke dosis maakt een voldoende dynamisch bereik in transmissiesnelheid mogelijk, zodat antivirale effecten van een kandidaat-geneesmiddel kunnen leiden tot beschermde dieren in hiv-preventie-experimenten en verminderde virale belasting voor behandelingsstudies.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ernstig immuungecompromitteerde muisstam NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) is uitermate geschikt voor transplantatie van menselijke cellen en weefsels. Zowel aangeboren als adaptieve immuuntrajecten bij deze muizen zijn gecompromitteerd. NOG- en NSG-muizen herbergen een Prkdcscid mutatie die resulteert in een defecte T- en B-celfunctie. Bovendien missen deze muizen een functionele interleukine-2 receptor γ-keten (gemeenschappelijke gammakete…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de medewerkers van de Biomedicine Animal Facility van de Universiteit van Aarhus, in het bijzonder mevrouw Jani Kær, bedanken voor de inspanningen van de kolonieen en voor het bijhouden van muisgewichten. De auteurs willen professor Florian Klein bedanken voor de ontwikkeling van standaard-of-care cART en voor begeleiding. De volgende reagens werd verkregen via de NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) van Dr. John Kappes en Dr Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
