הומניזציה חעוגה עכברים עבור חשיפה Intravaginal HIV וטיפול בזיהום HIV
Summary
פיתחנו פרוטוקול עבור הדור והערכה של הומניזציה ונגיף הכשל החיסוני האנושי חעוגה מודל העכבר מבוסס על השתלת תא גזע, הנגיף החיסוני intravaginal האדם חשיפה, ו-droplet דיגיטלי PCR RNA כימות.
Abstract
עכברים הומניזציה לספק פלטפורמה מתוחכמת כדי ללמוד וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ולבדוק תרופות אנטי ויראליות. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של מערכת חיסונית אנושית בעכברים חעוגה למבוגרים. כאן, אנו מסבירים את כל הצעדים המעשיים מבידוד של דם הטבור הנגזר של האדם CD34 + תאים והשתלת העירוי הבאים שלהם לתוך העכברים, כדי מניפולציה של המודל באמצעות זיהום HIV, טיפול תרופתי שילוב ( עגלה), ודגימת דם. כ 75,000 התאים hCD34 + מוזרק באופן מבוקר לתוך העכברים ורמת הצ האנושי, הידוע גם בשם הומניזציה, בדם היקפי מוערך longitudinally במשך חודשים על ידי cy try זרימה. סך של 75,000 hCD34 + תאים תשואות 20% – 50% האדם CD45 + תאים בדם היקפי. העכברים רגישים לזיהום intravaginal עם HIV ודם ניתן לטעום פעם שבועית לניתוח, וחודשיים פעמיים לתקופות ממושכות. פרוטוקול זה מתאר את השיטה עבור כימות של עומס פלזמה ויראלי באמצעות ה-PCR הדיגיטלי של droplet (ddPCR). אנו מראים כיצד ניתן לטפל באופן יעיל בעכברים באמצעות משטר עגלה סטנדרטי בדיאטה. המשלוח של עגלה בצורה של צ’או עכבר רגיל הוא עידון משמעותי של המודל הניסיוני. מודל זה יכול לשמש ניתוח טרום קליני של שני מערכתית ואקטואלי לקדם חשיפה מניעה, כמו גם עבור בדיקות של טיפולים חדשניים ואסטרטגיות לריפוי HIV.
Introduction
נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא זיהום כרוני עם יותר מ 37,000,000 אנשים נגועים ברחבי העולם1. טיפול ויראלי משולב (עגלה) הוא טיפול מציל חיים, אבל עדיין מוצדקת תרופה. לפיכך, יש צורך במודלים של חיות המראות את מערכת החיסון האנושית ואת תגובותיהם כדי להקל על המשך המחקר ב-HIV. סוגים מרובים של עכברים הומניסטים כי הם מסוגלים לתמוך תאים ורקמות הרקמה פותחו על ידי שתילת תאים אנושיים לתוך עכברים לקוי בחומרה2. עכברים כאלה הומניזציה רגישים לזיהום HIV ולספק חלופה חשובה הפרימטים מודל הכשל החיסוני של האדם, כפי שהם זולים יותר ופשוטים יותר לשימוש מאשר פרימטים אנושיים. עכברים הומניזציה יש מחקר הקלה שידור HIV ויראלי, פתוגנזה, מניעה, טיפול3,4,5,6,7,8,9,10,11.
אנו מציגים מערכת גמישה מודל הומניזציה עבור מחקר HIV שפותחה על ידי שתילת דם טבורי הזרע בתאי גזע האדם לתוך עכברים של נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/jictac (חעוגה) רקע. מלבד היותו של מוצא לא עוברי, הביוהנדסה המעשית של עכברים אלה היא פחות מבחינה טכנית תובענית לעומת ההליכים יקרוכירורגית המעורבים השתלת הכבד בדם בלוטת התימוס (בייקון) לבנות.
אנו מראים כיצד ליצור זיהום HIV באמצעות שידור intravaginal וכיצד לנטר את העומס ויראלי פלזמה עם התקנה המבוססת על ה-droplet דיגיטלי (ddPCR) רגיש. לאחר מכן, נתאר את הקמת העגלה הסטנדרטית הניתנת כחלק מדיאטת העכבר היומית. מטרת השיטות המשולבות הללו היא להפחית את הלחץ לבעלי החיים ולהקל על ניסויים בקנה מידה גדול שבהם הזמן המושקע בטיפול בכל בעל חיים מוגבל ל-12.
בבני אדם, CCR5Δ32/wt או CCR5Δ32/δ 32 גנוטיפ גורם מופחת רגישות לזיהום HIV עם משדר/מייסד וירוסים13, ואמצעי זהירות יש לנקוט כאשר ביולוגי הומניזציה עכברים עם תאי גזע לצורך לימודי HIV. הדבר נכון במיוחד באזורנו, מכיוון שמשתנים באופן טבעי ב- CCR5 gene, במיוחד δ 32 מחיקות, נפוצים יותר באוכלוסיות מקוריות סקנדינביות ובלטיות בהשוואה לשאר העולם14,15. כך, הפרוטוקול שלנו כולל שיטת קל, תפוקה גבוהה עבור הקרנת תאי גזע המטפאות עבור משתנים CCR5 לפני ההשתלה.
עבור החשיפה הintravaginal בחרנו את המשדר/מייסד R5 וירוס RHPA4259, מבודד מאישה בשלב מוקדם של זיהום שהיה נגוע intravaginally16. אנו חושפים את העכברים למינון נגיפי שהספיק להניב שידור מוצלח ברוב העכברים, אבל מתחת לקצב השידור 100%. בחירת מנה כזו מאפשרת טווח דינמי מספיק בקצב השידור, כך שהשפעות אנטי ויראליות של מועמד תרופתי יכולות לגרום לבעלי חיים מוגנים בניסויים במניעת HIV ולהפחית את העומס הנגיפי ללימודי הטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמץ חיסוני חמורה ביותר העכבר נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/jictac (חעוגה) הוא מאוד מתאים להשתלה של תאים אנושיים ורקמות. שני המסלולים החיסונית מולדים מסתגלת בעכברים האלה הם פרוצים. חעוגה ו NSG עכברים הנמל מוטציהSckdc סקאיד שתוצאתה תפקוד פגום T ו-B תא. יתר על כן, עכברים אלה ח…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות ביודינין בעלי חיים באוניברסיטת אורהוס, במיוחד גב’ יאני Kær למאמצי תחזוקת המושבה ולמעקב אחר משקולות העכבר. המחברים רוצים להודות לפרופסור פלורינה קליין על פיתוח עגלה סטנדרטית לטיפול ולהדרכה. הכימית הבאה הושגה דרך התוכנית לטיפול ב-NIH איידס, חטיבת האיידס, NIAID, NIH: pRHPA. c/2635 (קטלוג 11744) מ ד ר ג’ון Kappes וד ר כריסטינה אוחסנבאואר.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
