हमने स्टेम सेल ट्रांसप्लांट, इंट्रोवर्जिनल ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस एक्सपोजर और ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर आरएनए के आधार पर एक मानवीय और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस संक्रमित एनओजी माउस मॉडल के उत्पादन और मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । मात्राकरण।
मानवीकृत चूहे मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) वायरोलॉजी का अध्ययन करने और एंटीवायरल दवाओं का परीक्षण करने के लिए एक परिष्कृत मंच प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल वयस्क NOG चूहों में एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना का वर्णन करता है। यहां, हम गर्भनाल रक्त के अलगाव से सभी व्यावहारिक कदम ों की व्याख्या मानव CD34 + कोशिकाओं और चूहों में उनके बाद नसों प्रत्यारोपण, एचआईवी संक्रमण के माध्यम से मॉडल के हेरफेर के लिए, संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी ( कला), और रक्त नमूना। लगभग 75,000 hCD34 + कोशिकाओं को चूहों में नसों में इंजेक्ट किया जाता है और मानव कल्पना के स्तर, जिसे मानवीकरण के रूप में भी जाना जाता है, परिधीय रक्त में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा महीनों के लिए देशीय रूप से अनुमान लगाया जाता है। कुल 75,000 hCD34+ कोशिकाओं परिधीय रक्त में 20%-50% मानव CD45 + कोशिकाओं की पैदावार। चूहों एचआईवी और रक्त के साथ intravaginal संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते है विश्लेषण के लिए एक बार साप्ताहिक नमूना किया जा सकता है, और दो बार विस्तारित अवधि के लिए मासिक । यह प्रोटोकॉल ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) का उपयोग करके प्लाज्मा वायरल लोड की मात्रा के लिए एक परख का वर्णन करता है। हम दिखाते हैं कि चूहों को आहार में मानक-देखभाल कला आहार के साथ प्रभावी ढंग से कैसे इलाज किया जा सकता है। नियमित माउस चाउ के रूप में कैआरटी का वितरण प्रायोगिक मॉडल का एक महत्वपूर्ण शोधन है। इस मॉडल का उपयोग प्रणालीगत और सामयिक प्री-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस यौगिकों के साथ-साथ उपन्यास उपचार और एचआईवी इलाज रणनीतियों के परीक्षण के लिए प्रीनैदानिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी)दुनियाभर में 37 मिलियन से अधिक संक्रमित व्यक्तियों के साथ एक पुराना संक्रमण है। कॉम्बिनेशन एंटीवायरल थेरेपी (cART) एक जीवन रक्षक चिकित्सा है, लेकिन एक इलाज अभी भी आवश्यक है । इस प्रकार, एचआईवी में निरंतर अनुसंधान को सुविधाजनक बनाने के लिए मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और इसकी प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित करने वाले पशु मॉडलों की आवश्यकता है। मानव कोशिकाओं को गंभीर रूप से इम्यूनोडिफिजेंट चूहों2में प्रत्यारोपित करके कई प्रकार के मानवीकृत चूहों को विकसित किया गया है जो कोशिका ओं और ऊतकों के engraftment का समर्थन करने में सक्षम हैं। इस तरह के मानवीकृत चूहों एचआईवी संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और अमानवीय रहनुमा सिमियन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प प्रदान करते हैं, क्योंकि वे गैर-मानव वानरों की तुलना में उपयोग करने के लिए सस्ता और सरल हैं। मानवीकृत चूहों ने एचआईवी वायरल ट्रांसमिशन, रोगजनन, रोकथाम औरउपचार3,4,5,6,7,8,9,10,11में अनुसंधान की सुविधा प्रदान की है।
हम एचआईवी अनुसंधान के लिए एक लचीला मानवीय मॉडल प्रणाली प्रस्तुत गर्भनाल रक्त संवित मानव स्टेम कोशिकाओं को संक्षेप में चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा विकसित की है । सीजी-पीआरकेडीसीसिडआईएल2आरजीtm1Sug/JicTac(NOG) पृष्ठभूमि । गैर-भ्रूण मूल के होने के अलावा, रक्त-यकृत-थाइमस (बीबीटी) के निर्माण के प्रत्यारोपण में शामिल माइक्रोसर्जिकल प्रक्रियाओं की तुलना में इन चूहों की व्यावहारिक बायोइंजीनियरिंग तकनीकी रूप से कम मांग कर रही है।
हम दिखाते हैं कि इंट्रावेजिनल ट्रांसमिशन के माध्यम से एचआईवी संक्रमण को कैसे स्थापित किया जाए और संवेदनशील ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) आधारित सेटअप के साथ प्लाज्मा वायरल लोड की निगरानी कैसे की जाए। बाद में, हम दैनिक माउस आहार के हिस्से के रूप में दिए गए मानक कला की स्थापना का वर्णन करते हैं। इन संयुक्त तरीकों का उद्देश्य जानवरों के लिए तनाव को कम करना और बड़े पैमाने पर प्रयोगों की सुविधा देना है जहां प्रत्येक जानवर को संभालने में समय सीमित12है ।
मनुष्यों में, एक सीसीआर532/wt या CCR532/32 जीनोटाइप ट्रांसमीटर/संस्थापक वायरस13के साथ एचआईवी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता को कम करता है, और कुछ सावधानियां तब बरतनी चाहिए जब एचआईवी अध्ययन के उद्देश्य से स्टेम सेल के साथ बायोइंजीनियरिंग चूहों को मानवीय बनाया जाता है । यह हमारे क्षेत्र में विशेष रूप से सच है क्योंकि CCR5 जीन में स्वाभाविक रूप से होने वाले वेरिएंट, विशेष रूप से 32 विलोपन, स्कैंडिनेवियाई और बाल्टिक देशी आबादी में दुनिया के बाकी हिस्सों की तुलना में अधिक प्रचलित हैं14,15। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल में प्रत्यारोपण से पहले CCR5 वेरिएंट के लिए दाता हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल की स्क्रीनिंग के लिए एक आसान, उच्च थ्रूपुट परख शामिल है।
इंट्रावजिनल एक्सपोजर के लिए हमने ट्रांसमीटर/संस्थापक R5 वायरस RHPA4259 को चुना, जो संक्रमण के प्रारंभिक चरण में एक महिला से अलग था जो संक्रमित संक्रमित16था । हमने चूहों को एक वायरल खुराक के लिए उजागर किया जो चूहों के बहुमत में सफल संचरण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था, लेकिन 100% पारेषण दर से नीचे। इस तरह की खुराक का चयन ट्रांसमिशन दर में पर्याप्त गतिशील रेंज को सक्षम बनाता है जैसे कि दवा उम्मीदवार के एंटीवायरल प्रभाव एचआईवी रोकथाम प्रयोगों में संरक्षित जानवरों में परिणाम दे सकते हैं और उपचार अध्ययन के लिए वायरल लोड में कमी आ सकती है।
गंभीर रूप से इम्यूनोसमझौता माउस तनाव NOD। सीजी-पीआरकेडीसीसिडआईएल2आरजीtm1Sug/JicTac(NOG) मानव कोशिकाओं और ऊतकों के प्रत्यारोपण के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है । इन चूहों में जन्मजात और अनु…
The authors have nothing to disclose.
लेखक आरोहस विश्वविद्यालय में बायोमेडिसिन पशु सुविधा कर्मचारियों, विशेष रूप से कॉलोनी रखरखाव के प्रयासों के लिए और माउस वजन पर नज़र रखने के लिए सुश्री जानी Kær का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक ों को मानक की देखभाल cART के विकास के लिए और मार्गदर्शन के लिए प्रोफेसर फ्लोरियन क्लीन शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । निम्नलिखित अभिकर्ता NIH एड्स अभिकर्ता कार्यक्रम, एड्स के प्रभाग, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (बिल्ली # ११७४४) डॉ जॉन Kappes और डॉ क्रिस्टीना Ochsenbauer से प्राप्त किया गया था ।
Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
Flowjo v.10 | |||
Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
Heating lamp | Custom made | ||
Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
Mouse restrainer | Custom made product | ||
Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
Proteinase K | NEB | 100005398 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
Trypane blue | Sigma | T8154 | |
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |