Humaniserte NOG-mus for intravaginal HIV-eksponering og behandling av HIV-infeksjon
Summary
Vi har utviklet en protokoll for generering og evaluering av en humanisert og human immunsvikt virus-infisert NOG musemodell basert på stamcelletransplantasjon, intravaginal humant immunsvikt virus eksponering, og droplet digital PCR RNA Kvantifisering.
Abstract
Humaniserte mus gir en sofistikert plattform for å studere humant immunsviktvirus (HIV) virologi og for å teste antivirale legemidler. Denne protokollen beskriver etableringen av et menneskelig immunsystem hos voksne NOG-mus. Her forklarer vi alle de praktiske trinnene fra isolering av navlestrengblod avledet humane CD34+ celler og deres påfølgende intravenøstransplantasjon i musene, til manipulering av modellen gjennom HIV-infeksjon, kombinasjon antiretroviral behandling ( cART), og blodprøvetaking. Omtrent 75 000 hCD34+ celler injiseres intravenøst i musene og nivået av menneskelig chimerisme, også kjent som humanisering, i perifert blod er estimert langsgående i måneder ved flyt cytometri. Totalt 75 000 hCD34+-celler gir 20 %–50 % humane CD45+-celler i perifert blod. Musene er utsatt for intravaginal infeksjon med HIV og blod kan prøves en gang i uken for analyse, og to ganger månedlig i lengre perioder. Denne protokollen beskriver en analyse for kvantifisering av plasma virusbelastning ved hjelp av droplet digital PCR (ddPCR). Vi viser hvordan musene effektivt kan behandles med et standard-of-care cART diett i kostholdet. Levering av cART i form av vanlig mus chow er en betydelig raffinement av eksperimentell modell. Denne modellen kan brukes til preklinisk analyse av både systemiske og aktuelle pre-eksponering profylakse forbindelser samt for testing av nye behandlinger og HIV kur strategier.
Introduction
Humant immunsviktvirus (HIV) er en kronisk infeksjon med mer enn 37 millioner infiserte personer over heleverden. Kombinasjon antiviral terapi (cART) er en livreddende terapi, men en kur er fortsatt berettiget. Dermed er det behov for dyremodeller som speiler det menneskelige immunforsvaret og dets svar for å lette fortsatt forskning på HIV. Flere typer humaniserte mus som er i stand til å støtte celle- og vevsengraftment, er utviklet ved å transplantere menneskelige celler til alvorlig immundeficient mus2. Slike humaniserte mus er utsatt for HIV-infeksjon og gir et viktig alternativ til ikke-humane primatsimiane immunsviktvirusmodeller, da de er billigere og enklere å bruke enn ikke-menneskelige primater. Humaniserte mus har tilrettelagt forskning i HIV viral overføring, patogenesen, forebygging, og behandling3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presenterer et fleksibelt humanisert modellsystem for HIV-forskning utviklet ved å transplantere ledningsblod avledet menneskelige stamceller til mus i NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) bakgrunn. Foruten å være av ikke-føtal opprinnelse, er den praktiske bioengineering av disse musene mindre teknisk krevende i forhold til mikrokirurgiske prosedyrer involvert i transplantasjon av blodlever-thymus (BLT) konstruksjon.
Vi viser hvordan du etablerer HIV-infeksjon gjennom intravaginal overføring og hvordan du overvåker plasma virusbelastningen med en sensitiv dråpe digital PCR (ddPCR)-basert oppsett. Deretter beskriver vi etableringen av standard cART gitt som en del av det daglige musedietten. Målet med disse kombinerte metodene er å redusere stress for dyrene og legge til rette for store eksperimenter der tid brukt håndtering av hvert dyr er begrenset12.
Hos mennesker forårsaker en CCR5Δ32/wt eller CCR5Δ32/ Δ32 genotype redusert følsomhet for HIV-infeksjon med sender/grunnleggervirus13, og noen forholdsregler må tas når bioengineering humaniserte mus med stamceller med det formål med HIV-studier. Dette gjelder spesielt i vår region fordi naturlig forekommende varianter i CCR5 genet, spesielt Δ32 slettinger, er mer utbredt i skandinaviske og baltiske innfødte populasjoner sammenlignet med resten av verden14,15. Dermed inkluderer vår protokoll en enkel, høy gjennomstrømningsanalyse for screening av donorhematopoetiske stamceller for CCR5-varianter før transplantasjon.
For intravaginal eksponering valgte vi senderen/grunnleggeren R5 virus RHPA4259, isolert fra en kvinne i et tidlig stadium av infeksjon som ble smittet intravaginalt16. Vi utsatte musene for en virusdose som var tilstrekkelig til å gi vellykket overføring i de fleste mus, men under en 100% overføringshastighet. Valg av en slik dose muliggjør et tilstrekkelig dynamisk område i overføringshastigheten slik at antivirale effekter av en legemiddelkandidat kan resultere i beskyttede dyr i HIV-forebyggende eksperimenter og redusert virusbelastning for behandlingsstudier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den alvorlig immunkompromitterte musen belastning NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) er ekstremt godt egnet for transplantasjon av menneskelige celler og vev. Både medfødte og adaptive immunveier i disse musene er kompromittert. NOG- og NSG-mus har enPrkdc-scidmutasjon som resulterer i defekt T- og B-cellefunksjon. Videre mangler disse musene en funksjonell interleukin-2 reseptor γ-kjede (vanlig gammakjede, IL2rg) som er uunnværlig i binding…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke biomedisin dyrefasilitetspersonalet ved Aarhus Universitet, spesielt Jani Kær for kolonivedlikeholdsarbeid og for å spore musevekter. Forfatterne vil gjerne takke professor Florian Klein for å utvikle standard-of-care cART og for veiledning. Følgende reagens ble innhentet gjennom NIH AIDS Reagent Program, Divisjon av AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (katt# 11744) fra Dr. John Kappes og Dr. Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
