Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV
Summary
Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.
Abstract
Camundongos humanizados fornecem uma plataforma sofisticada para estudar a virologia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e testar drogas antivirais. Este protocolo descreve o estabelecimento de um sistema imunológico humano em camundongos adultos NOG. Aqui, explicamos todos os passos práticos do isolamento das células CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical e seu subsequente transplante intravenoso para os camundongos, até a manipulação do modelo através da infecção pelo HIV, combinação de terapia antirretroviral ( cART), e amostragem de sangue. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ são injetadas por via intravenosa nos camundongos e o nível de chimerismo humano, também conhecido como humanização, no sangue periférico é estimado longitudinalmente por meses por citometria de fluxo. Um total de 75.000 células hCD34+ produz células CD45+ humanas no sangue periférico. Os camundongos são suscetíveis à infecção intravaginal com HIV e o sangue podem ser amostrados uma vez por semana para análise, e duas vezes mensais por longos períodos. Este protocolo descreve um ensaio para quantificação da carga viral plasmática usando pcR digital droplet (ddPCR). Mostramos como os camundongos podem ser efetivamente tratados com um regime de cART padrão de cuidado na dieta. A entrega do cART na forma de chow de rato regular é um refinamento significativo do modelo experimental. Este modelo pode ser usado para análise pré-clínica de compostos sistêmicos e tópicos de profilaxia pré-exposição, bem como para testes de novos tratamentos e estratégias de cura do HIV.
Introduction
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é uma infecção crônica com mais de 37 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo1. A terapia antiviral combinada (cART) é uma terapia que salva vidas, mas uma cura ainda é justificada. Assim, há a necessidade de modelos animais que espelham o sistema imunológico humano e suas respostas para facilitar a continuação da pesquisa no HIV. Múltiplos tipos de camundongos humanizados que são capazes de suportar o enenxerto celular e tecidual foram desenvolvidos transplantando células humanas em camundongos severamente imunodeficientes2. Esses camundongos humanizados são suscetíveis à infecção pelo HIV e fornecem uma alternativa importante aos modelos de vírus da imunodeficiência símia de primatas não humanos, pois são mais baratos e simples de usar do que primatas não humanos. Camundongos humanizados têm facilitado a pesquisa em transmissão viral do HIV, patopatismo, prevenção e tratamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Apresentamos um sistema de modelohumanizado flexível para pesquisa sobre HIV desenvolvido por transplantar células-tronco humanas derivadas do sangue do cordão umbilical em camundongos do ACENO. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) de fundo. Além de ser de origem não fetal, a bioengenharia prática desses camundongos é menos exigente tecnicamente em comparação com os procedimentos microcirúrgicos envolvidos no transplante da construção hepática-timo hemobiana (TBL).
Mostramos como estabelecer a infecção pelo HIV através da transmissão intravaginal e como monitorar a carga viral plasmática com uma configuração digital de gota sensível (ddPCR). Posteriormente, descrevemos o estabelecimento do cART padrão dado como parte da dieta diária do camundongo. O objetivo desses métodos combinados é reduzir o estresse aos animais e facilitar experimentos em larga escala onde o tempo gasto manuseando cada animal é limitadoem 12.
Em humanos, um genótipo CCR5Δ32/wt ou CCR5Δ32/ Δ32 causa redução da suscetibilidade à infecção pelo HIV com vírus transmissor/fundador13, e algumas precauções devem ser tomadas quando a bioengenharia humanizou camundongos com células-tronco para fins de estudos de HIV. Isso é especialmente verdade em nossa região porque variantes de ocorrência natural no gene CCR5, particularmente as exclusões de Δ32, são mais prevalentes em populações nativas escandinavas e bálticas em comparação com o resto do mundo14,15. Assim, nosso protocolo inclui um ensaio fácil e de alto nível para triagem de células-tronco hematopoiéticas para variantes CCR5 antes do transplante.
Para a exposição intravaginal escolhemos o vírus transmissor/fundador R5 RHPA4259, isolado de uma mulher em um estágio inicial de infecção que foi infectada intravaginalmente16. Nós expôs os camundongos a uma dose viral que foi suficiente para produzir transmissão bem sucedida na maioria dos camundongos, mas abaixo de uma taxa de transmissão de 100%. A escolha dessa dose permite uma faixa dinâmica suficiente na taxa de transmissão, de forma que os efeitos antivirais de um candidato a medicamentos possam resultar em animais protegidos em experimentos de prevenção do HIV e diminuição da carga viral para estudos de tratamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A tensão severamente imunocomprometida do mouse NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) é extremamente adequado para transplante de células e tecidos humanos. Tanto as vias imunes inatas quanto adaptativas nesses camundongos estão comprometidas. Os ratos NOG e NSG abrigam uma mutaçãoprkdc scid que resulta na função de células T e B defeituosas. Além disso, esses camundongos não possuem um receptor funcional de entrelaçana-2 (cadeia gama co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer à equipe do Biomedicine Animal Facility da Universidade de Aarhus, particularmente pela Sra. Jani Kær pelos esforços de manutenção da colônia e pelo rastreamento de pesos dos ratos. Os autores gostariam de agradecer ao professor Florian Klein pelo desenvolvimento do cART padrão de cuidado e pela orientação. O seguinte reagente foi obtido através do Nih AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) do Dr. John Kappes e Dr. Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
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