Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal
Summary
Hemos desarrollado un protocolo para la generación y evaluación de un modelo de ratón NOG infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y humanizado basado en el trasplante de células madre, la exposición al virus de inmunodeficiencia humana intravaginal y el ARN PCR digital de gotas Cuantificación.
Abstract
Los ratones humanizados proporcionan una plataforma sofisticada para estudiar la virología del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y para probar los medicamentos antivirales. Este protocolo describe el establecimiento de un sistema inmunitario humano en ratones NOG adultos. Aquí, explicamos todos los pasos prácticos desde el aislamiento de las células CD34+ humanas derivadas de la sangre del cordón umbilical y su posterior trasplante intravenoso en ratones, hasta la manipulación del modelo a través de la infección por VIH, la terapia antirretroviral combinada ( cART), y el muestreo de sangre. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ se inyectan por vía intravenosa en los ratones y el nivel de chimerismo humano, también conocido como humanización, en la sangre periférica se estima longitudinalmente durante meses por citometría de flujo. Un total de 75.000 células hCD34+ produce entre un 20% y un 50% de células CD45+ humanas en la sangre periférica. Los ratones son susceptibles a la infección intravaginal con VIH y la sangre se puede tomar muestras una vez por semana para su análisis, y dos veces al mes durante períodos prolongados. Este protocolo describe un ensayo para la cuantificación de la carga viral plasmática utilizando PCR digital de gotas (ddPCR). Mostramos cómo los ratones pueden ser tratados eficazmente con un régimen de cART estándar de cuidado en la dieta. La entrega de cART en forma de chow de ratón regular es un refinamiento significativo del modelo experimental. Este modelo se puede utilizar para el análisis preclínico de compuestos de profilaxis previas a la exposición sistémicas y tópicas, así como para la prueba de nuevos tratamientos y estrategias de curación del VIH.
Introduction
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una infección crónica con más de 37 millones de personas infectadas en todo el mundo1. La terapia antiviral combinada (cART) es una terapia que salva vidas, pero una cura todavía está justificada. Por lo tanto, es necesario modelos animales que reflejen el sistema inmunitario humano y sus respuestas para facilitar la investigación continua en el VIH. Múltiples tipos de ratones humanizados que son capaces de apoyar el injerto celular y tisular se han desarrollado trasplantando células humanas en ratones gravemente inmunodeficientes2. Estos ratones humanizados son susceptibles a la infección por el VIH y proporcionan una alternativa importante a los modelos de virus de inmunodeficiencia simio primateno no humano, ya que son más baratos y más fáciles de usar que los primates no humanos. Los ratones humanizados han facilitado la investigación en transmisión viral del VIH, patogénesis, prevención y tratamiento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Presentamos un sistema modelo humanizado flexible para la investigación del VIH desarrollado mediante el trasplante de células madre humanas derivadas de la sangre de cordón umbilical en ratones del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) fondo. Además de ser de origen no fetal, la bioingeniería práctica de estos ratones es menos técnicamente exigente en comparación con los procedimientos microquirúrgicos involucrados en el trasplante de la construcción de sangre-hígado-timo (BLT).
Mostramos cómo establecer la infección por VIH a través de la transmisión intravaginal y cómo monitorear la carga viral plasmática con una configuración sensible basada en PCR digital de gotas (ddPCR). Posteriormente, describimos el establecimiento de cART estándar dado como parte de la dieta diaria del ratón. El objetivo de estos métodos combinados es reducir el estrés a los animales y facilitar experimentos a gran escala en los que el tiempo dedicado al manejo de cada animal es limitado12.
En los seres humanos, un genotipo CCR532/wt o CCR532/32 provoca una menor susceptibilidad a la infección por VIH con los virus del transmisor/fundador13,y se deben tomar algunas precauciones cuando se deben tomar algunas precauciones cuando se bioingeniería de ratones humanizados con células madre con el fin de realizar estudios sobre el VIH. Esto es especialmente cierto en nuestra región porque las variantes naturales en el gen CCR5, en particular las deleciones de 32, son más frecuentes en las poblaciones nativas escandinavas y bálticas en comparación con el resto del mundo14,15. Por lo tanto, nuestro protocolo incluye un ensayo fácil y de alto rendimiento para el cribado de células madre hematopoyéticas de donantes para variantes ccr5 antes del trasplante.
Para la exposición intravaginal elegimos el virus transmisor/fundador R5 RHPA4259, aislado de una mujer en una etapa temprana de la infección que fue infectada por vía intravaginal16. Explamos a los ratones a una dosis viral que fue suficiente para producir una transmisión exitosa en la mayoría de los ratones, pero por debajo de una tasa de transmisión del 100%. La elección de una dosis de este tipo permite un rango dinámico suficiente en la velocidad de transmisión, de modo que los efectos antivirales de un candidato a un medicamento pueden dar lugar a animales protegidos en experimentos de prevención del VIH y disminución de la carga viral para los estudios de tratamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ratón gravemente inmunocomprometido tensa NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) es extremadamente adecuado para el trasplante de células y tejidos humanos. Las vías inmunitarias innatas y adaptativas en estos ratones están comprometidas. Los ratones NOG y NSG albergan una mutaciónscid de Prkdc que da como resultado una función celular T y B defectuosa. Además, estos ratones carecen de una cadena funcional de receptor de interleucina-2 (cad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias al personal de Biomedicine Animal Facility de la Universidad de Aarhus, en particular a la Sra. Jani Kor por los esfuerzos de mantenimiento de las colonias y por el seguimiento de los pesos de los ratones. Los autores quieren agradecer al profesor Florian Klein por desarrollar el cART estándar de atención y por su orientación. El siguiente reactivo se obtuvo a través del Programa de Reactivos de SIDA de NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) del Dr. John Kappes y la Dra. Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
