Vi presenterer en todelt protokoll som kombinerer fluorescerende kalsiumavbildning med in situ hybridisering, slik at eksperimentereren kan korrelere mønstre av kalsiumaktivitet med genuttrykksprofiler på et enkeltcellenivå.
Spontan intracellulær kalsiumaktivitet kan observeres i en rekke celletyper og foreslås å spille kritiske roller i en rekke fysiologiske prosesser. Spesielt er passende regulering av kalsiumaktivitetsmønstre under embryogenese nødvendig for mange aspekter ved virveldyr nevrale utvikling, inkludert riktig neural tube nedleggelse, synaptogenesis, og nevrotransmitter fenotype spesifikasjon. Mens observasjonen om at kalsiumaktivitetsmønstre kan variere i både frekvens og amplitude antyder en overbevisende mekanisme der disse fluksene kan overføre kodede signaler til nedstrøms effektorer og regulere genuttrykk, eksisterende tilnærminger på befolkningsnivå har manglet presisjonen som er nødvendig for å utforske denne muligheten ytterligere. Videre begrenser disse tilnærmingene studier av rollen til cellecelleinteraksjoner ved å utelukke evnen til å analysetilstanden til nevronal bestemmelse i fravær av cellecellekontakt. Derfor har vi etablert en eksperimentell arbeidsflyt som kombinerer tidsforløp kalsiumavbildning av dissosierte nevronale explants med en fluorescens i situ hybridiseringanalyse, slik at entydig korrelasjon av kalsiumaktivitetsmønster med molekylær fenotype på et enkeltcellenivå. Vi var vellykket i stand til å bruke denne tilnærmingen til å skille og karakterisere spesifikke kalsiumaktivitetsmønstre forbundet med å differensiere nevrale celler og nevrale stamceller, henholdsvis; utover dette kan imidlertid det eksperimentelle rammeverket som er beskrevet i denne artikkelen, lett tilpasses for å undersøke sammenhenger mellom enhver aktivitetsprofil i tidsserien og uttrykk for et gen eller gener av interesse.
Gratis cytosolic kalsium er avgjørende for en rekke biologiske prosesser, alt fra cellespredning og migrasjon til apoptose og autofagi1,2,3. Innenfor disse banene kan kalsium utøve nedstrømseffekter på genuttrykk ved å samhandle med kalsiumbindende domener for å indusere konformasjonsendringer som modulerer proteinaktivitet og interaksjoner. For eksempel holdes en nevronal kalsiumsensor kjent som Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) i en utfoldet mellomliggende konformasjon når den er bundet av kalsium, og hindrer det i å samhandle med protein- og DNA-målene4. Utover å tjene som et enkelt signalmolekyl, gjør imidlertid den dynamiske karakteren av intracellulære kalsiumtransienter disse aktivitetsmønstrene å kode mer komplekse amplitude- eller frekvensbaserte signaler5,6. Kjernefysisk overføring av transkripsjonsfaktoren kjernefysisk faktor av aktiverte T-celler (NFAT) forsterkes av høyfrekvente kalsiumsvingninger, men hemmes av lavfrekvente svingninger7. Overbevisende, nyere arbeid har antydet at NFAT kan faktisk lydhør for kumulativ kalsiumeksponering8. Både kalsineurin og Ca2+/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII) viser også tydelige svar på kalsiumtransienter av en bestemt frekvens, varighet eller amplitude9. For å legge til et ekstra nivå av regulatorisk kompleksitet, beregningsmodeller tyder på at mange nedstrøms kalsiumbindende proteiner blir mer eller mindre frekvensavhengige som svar på tilstedeværelsen eller fraværet av bindende konkurrenter10,11.
Innenfor det utviklende nervesystemet er to hovedklasser av kalsiumaktivitetsatferd definert og forbundet med spesifikke biologiske prosesser. Kalsiumtilstrømninger klassifiseres som “pigger” hvis de oppstår i individuelle celler, når en toppintensitet på ~ 400% av grunnlinjen innen fem sekunder, og viser dobbel eksponentiell forfall12. Denne typen signal er forbundet primært med nevrotransmitter fenotype spesifikasjon13. I motsetning er “bølger” definert som langsommere, mindre ekstreme kalsiumtransienter der en celles intracellulære kalsiumkonsentrasjon stiger til ~ 200% av baseline over en periode på tretti sekunder eller mer, og forfaller deretter over flere minutter12. Disse signalene ofte forplante seg over flere nærliggende celler, og deres tilstedeværelse har vært forbundet med nøysom mekultur og cellespredning14,15. Men selv om disse to klassene er definert basert på karakteristiske kinetiske profiler, er det fortsatt uklart nøyaktig hvilke egenskaper ved disse mønstrene som faktisk oppdages av celler og oversettes av nedstrøms effektorer.
Å forstå forholdet mellom intracellulære kalsiumsvingninger og genuttrykk ville gi avgjørende innsikt i en av de regulatoriske mekanismene som sikrer riktig utvikling og mønster av nervesystemet. For dette formål har studier av den embryonale ryggmargen vist at økt kalsiumtoppaktivitet under utvikling er forbundet med høyere nivåer av hemmende nevroner, mens redusert kalsiumspikeaktivitet er forbundet med høyere nivåer av eksitatoriske nevroner13. Imidlertid har disse befolkningsnivå analysene ikke blitt brukt til å knytte kalsiumaktivitet med genuttrykk på et enkeltcellenivå.
Nærmer seg disse spørsmålene på nivået av enkeltcellen tilbyr flere forskjellige fordeler fremfor tidligere arbeid. For det første tillater evnen til å vurdere kalsiumaktivitet og genuttrykk i mange celler individuelt at det fulle repertoaret av distinkte aktivitetsmønstre observeres uten å bli obfuscated av en bulk-nivå måling. I tillegg betyr det å studere disse relasjonene i encelles primærkultur at celleautonome koblinger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk vil bli opprettholdt, mens interaksjoner som krever cellecellekommunikasjon vil bli avskaffet. Derfor gjør denne tilnærmingen at disse celle-autonome mekanismene kan studeres isolert. Det gjør det imidlertid også at rollen som ikke-celle-autonom kalsiumaktivitet skal belyses og forhøres. For eksempel kan celler dissekeres fra et embryo på nevrale platestadiet, dyrket til søskenkontroller når nevrale rørstadiet, og deretter sammenlignet med celler som har blitt nydissekert fra et neural-tube-stadium embryo. Dette tillater direkte sammenligning av celler som beholdt celle-celle kommunikasjon over en viktig utviklingsperiode til de der celle-celle kommunikasjon ble avskaffet.
I forsøket på å løse begrensningene i tidligere eksperimentelle tilnærminger, utviklet vi en protokoll som ville muliggjøre vurdering av både kalsiumaktivitet og genuttrykk i individuelle nevrale stamceller, noe som letter korrelasjonen av spesifikke aktivitetsmønstre med påfølgende differensieringsprogrammer. Neuralt vev ble dissekert fra Xenopus laevis på ulike stadier av neural utvikling, dissosiert i enkeltceller, og avbildet via konfokal mikroskopi i nærvær av en fluorescerende kalsiumindikator. Etter live-celle bildebehandling ble prøver løst og sayed via fluorescens in situ hybridization (FISH) for å oppdage uttrykk for et gen eller isoform av interesse. Viktigere, individuelle celler kan spores på tvers av begge bildeforsøk, noe som betyr at en celles kalsiumaktivitetsprofil og genuttrykksnivået kan knyttes til hverandre (Figur 1). Protokollen som rapporteres her er ment å undersøke sammenhenger mellom kalsiumaktivitetsmønstre og genuttrykk på tvers av embryonisk nevroutvikling i Xenopus laevis. Imidlertid kan det bredere eksperimentelle rammeverket (encellede time-course imaging etterfulgt av FISH og bildecoregistration) endres og brukes på nesten alle celletyper, fluorescerende reporter og et gen av interesse.
Karakteristiske mønstre av kalsiumaktivitet har blitt observert i cellene som utgjør det utviklende nervesystemet, med bestemte typer aktivitet forbundet med forskjellige neurodevelopmentale prosesser. Imidlertid krever ytterligere forståelse av mekanismene som disse informasjonstette aktivitetsmønstrene oversettes til transkripsjonelle svar, informasjon om kalsiumaktivitet og genuttrykk som samles inn med encellede oppløsning. Mens systemer som viser mer stereotypisk kalsiumaktivitet, som modne nevroner, med rimelighet kan sammenlignes på et bulknivå, maskeres de uregelmessige mønstrene som karakteriserer det embryonale nervesystemet lett av mindre presise opptak.
Det eksperimentelle rammeverket som er etablert i denne protokollen, kan enkelt tilpasses et bredt utvalg av celletyper og fluorescerende journalister. Vev som inneholder nesten alle celletyper eller kombinasjonav celletyper kan dissekeres fra en modellorganisme av interesse og belagt for encellede avbildning. I tillegg til å tillate celleidentifikasjon og isolere effekten av celleautonome prosesser, gjør en primær cellekulturtilnærming at eksperimentereren kan definere mediekomponenter etter ønske. For eksempel har eksperimenter som sammenligner aktiviteten til nevronale forløpere i 2 mM Ca2 + løsning blitt utført for å undersøke om forholdet mellom spike frekvens og nevrotransmitter fenotype i embryonale ryggmargen kan rekapituleres uten påvirkning av celle-celle interaksjoner13,20.
Mens denne protokollen utnytter fluorescerende markør Fluo4-AM for å oppdage intracellulær kalsiumaktivitet, avhengig av utvalgskriteriene, kan brukerne velge andre kommersielt tilgjengelige markører21, inkludert genetisk kodede kalsiumindikatorer. På samme måte kan alternative markører brukes til å overvåke dynamiske endringer i konsentrasjonen av en ion av interesse (inkludert K+,Na+og Zn2+), membranpotensial eller cellulær pH. Bildeinnstillinger og bildevarighet kan endres etter behov.
Selv om vi korrelerte kalsiumaktivitet og nevronal fenotype som et bestemt program, gjelder denne metoden også for en rekke andre cellulære egenskaper. For eksempel kan fluorescens i situ hybridisering utføres med sonder mot ethvert gen av interesse, inkludert nevronal markør ChAT eller transkripsjonsfaktoren Engrailed, slik at sensitiv påvisning av et passelig panel av mRNA-arter. Disse sondene kan utformes for å være isoform-spesifikke, som støtter ytterligere målspesifisitet hvis ønskelig. Dobbel FISK kan utføres ved hjelp av sonder konjugert til flere to forskjellige fluoropforer, slik at samtidig vurdering av uttrykket av flere gener. Imidlertid er de ekstra vaskene som kreves av denne typen eksperiment forbundet med økt sjanse for celletap eller bevegelse og krever erfaring og delikatesse som skal utføres med hell.
Uavhengig av eventuelle eksperimentspesifikke endringer som er gjort i denne protokollen, er det flere viktige trinn som krever nøye oppmerksomhet. Desseksjoner bør utføres med forsiktighet for å fjerne alt forurensende vev eller cellepopulasjoner; fordi romlig mønster går tapt når eksplantene er dissosiert, vil eventuelle gjenværende celler fra nærliggende vev bli ispedd og umulig å skille fra cellene av interesse. Etter at cellene er belagt, bør prøvene håndteres så forsiktig som mulig for å hindre at celler løsner. Viktigst av alt betyr dette at alle løsningsendringer bør utføres sakte og forsiktig, med pipetten plassert på kanten av platen når oppløsningen fjernes og legges til. Dette vil sikre at cellene trygt kan identifiseres i både kalsium- og FISH-bilder. Hvis celler forstyrres under behandlingen, kan det være umulig å identifisere noen eller alle de tilsvarende cellene mellom de to bildene. Vi anbefaler at du bruker disse oppgavene på siden av forsiktighet med disse oppgavene, slik at bare entydig tilsvarende celler brukes til videre analyse.
Avhengig av det biologiske spørsmålet som tas opp, kan en rekke analysetilnærminger være hensiktsmessige. Kalsiumaktivitet i tidsserien kan behandles og kvantifiseres på en rekke måter, med fleksibilitet i valg av de-trending parametere, analyseberegninger og analyseparametere (for eksempel % av baseline terskelen som brukes til å definere en kalsiumpigg). Sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og nivå av genuttrykk kan trekkes ved å analysere genuttrykk som en absolutt eller relativ fluorescensverdi hentet fra FISH-bildet. Alternativt kan sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk (tilstedeværelse/fravær) trekkes ved å definere en fluorescensterskel for positivt genuttrykkssignal og tildele “ja” eller “nei” identifikatorer til individuelle celler. Som helhet gir dette eksperimentelle skjemaet en utrolig fleksibel rørledning for innsamling og foreløpig analyse av tidsseriedata i forbindelse med cellesamsvarende genuttrykksdata. Slike eksperimenter vil være avgjørende for bedre å forstå de komplekse relasjonene mellom cellulær dynamikk og transkripsjonelle endringer, som eksemplifisert ved identifisering av kalsiumaktivitetsmønstre karakteristisk for hemmende-fated og eksitatorisk-fated nevronale forløpere i embryonale Xenopus laevis.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Wendy Herbst og Lindsay Schleifer for deres bidrag til utviklingen av disse protokollene. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 og 1R15HD096415-01) til MSS.
For Animal Husbandry & Cell Culture | |||
CHORULON (chorionic gonodotropin) | Merck Animal Health | ||
Gentamycin sulfate salt | Millipore Sigma | G1264 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521 | |
Collagenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Dumont #55 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dumont #5 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
For Calcium Imaging | |||
Fluo-4, AM, cell permeant | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
For RNA Probe Generation | |||
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
rATP | Promega | P1132 | |
rCTP | Promega | P1142 | |
rGTP | Promega | P1152 | |
rUTP | Promega | P1162 | |
Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
T3 RNA Polymerase | Promega | P2083 | |
T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
RQ1 Rnase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
For Fluorescence In Situ Hybridization | |||
Acetic Anhydride | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
Blocking Reagent | Millipore Sigma | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Millipore Sigma | 11207733910 | |
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
Solution Components | |||
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | C3306 | |
CHAPS hydrate | Millipore Sigma | C3023 | |
Denhardt's Solution (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Millipore Sigma | E3889 | |
Formamide (Deionized) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Millipore Sigma | H3393 | |
HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore Sigma | H1109 | |
L-Cysteine | Millipore Sigma | 168149 | |
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous | Fisher Scientific | AC413480050 | |
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX | Millipore Sigma | R3629 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S7653 | |
Triethanolamine | Millipore Sigma | 90279 | |
Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
Equipment | |||
Laminar Flow Hood | model of choice | ||
Dissecting Microscope | model of choice | ||
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | TE200 | |
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Shaking Incubator | model of choice | ||
Refrigerated Centrifuge | model of choice | ||
Miscellaneous | |||
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity | Millipore Sigma | CLS430769 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |