Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.
Abstract
Anticorpos monoclonais são drogas multifuncionais de alta afinidade que trabalham por mecanismos independentes variáveis para eliminar células cancerígenas. Ao longo das últimas décadas, o campo de conjugados anticorpos, anticorpos bisespecíficos, receptores de antígeno quimérico (CAR) e imunoterapia contra o câncer emergiu como a área mais promissora de investigações básicas e terapêuticas. Com numerosos testes em humanos bem-sucedidos visando receptores de ponto de verificação imunológicos e células CAR-T em leucemia e melanoma em um ritmo inovador, são tempos altamente emocionantes para terapêuticas oncológicas derivadas de variações da engenharia de anticorpos. Lamentavelmente, um número significativamente grande de anticorpos e terapêutica baseada em CAR também se mostrou decepcionante em testes em humanos de cânceres sólidos devido à limitada disponibilidade de células de efeito imunológico no leito tumoral. É importante ressaltar que a distribuição inespecífica de anticorpos terapêuticos em tecidos diferentes dos tumores também contribui para a falta de eficácia clínica, toxicidade associada e falha clínica. Como a tradução fiel de estudos pré-clínicos em trilhas clínicas humanas são altamente confiadas na eficácia e estudos de segurança do xenoenxerto de tumores de camundongos, aqui destacamos um método para testar o tumor e a distribuição geral de tecidos de anticorpos terapêuticos. Isso é conseguido rotulando o anticorpo purificado proteína-A com corante fluorescente infravermelho próximo seguido de imagem viva de camundongos portadores de tumores.
Introduction
A FDA aprovou o primeiro anticorpo monoclonal direcionado ao CD3 (OKT3, Muromonab) em 19861,2. Desde então, nos próximos vinte anos, houve uma rápida explosão no campo da engenharia de anticorpos devido ao sucesso esmagador de anticorpos contra inibidores de ponto de verificação imunológico3. Além da ativação indireta do sistema imunológico, os anticorpos estão sendo destinados a sinalizar diretamente as células cancerígenas para engajar precisamente as células efeitológicas, desencadear a citotoxicidade através do agonista do receptor da morte, bloquear a sinalização de sobrevivência das células tumorais, obstruir a angiogênese (crescimento dos vasos sanguíneos), restringir os reguladores imunológicos, fornecer radioisótopos, drogas de quimioterapia e siRNA como agentes conjugados2. Além disso, estudar os fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de vários anticorpos na superfície das células T derivadas do paciente e células NK (CAR-T e CAR-NK) é uma área de rápido crescimento das investigações clínicas para terapias baseadas em células4.
A afinidade ultra-alta de drogas à base de anticorpos que fornecem seletividade para células tumorais expressas de antígeno torna-o um agente atraente. Da mesma forma, a entrega direcionada e a retenção tumoral de um anticorpo terapêutico (ou uma droga química) é a chave para equilibrar a eficácia sobre a toxicidade. Portanto, um grande número de estratégias baseadas em engenharia de proteínas que incluem, mas não se limitam a anticorpos bisespecíficos5 e tri-específicos6 estão sendo explorados para melhorar significativamente a retenção otimizada de tumores de intravenosamente (IV) injetável terapêutica5,7. Aqui, descrevemos um método simples baseado em fluorescência para abordar a distribuição de tumores e tecidos de anticorpos anticâncicos potencialmente eficazes.
Como os tecidos animais possuem auto-fluorescência quando excitados em espectro visível, os anticorpos foram inicialmente rotulados com corante infravermelho próximo (por exemplo, IRDye 800CW). Para provas de investigações conceituais, fizemos uso do receptor de folato alfa-1 (FOLR1) visando anticorpos chamados farletuzumab e seu derivado chamado ativador de citotoxicidade de âncora bispecífica (BaCa)7 anticorpo que co-visa FOLR1 e receptor de morte-5 (DR5)8 em um anticorpo recombinante. FOLR1 é um receptor-alvo superexpresso bem definido em células cancerígenas ovarianas e TNBC, xenoenxertos tumorais e tumores de pacientes9. Notavelmente, existem múltiplos esforços para explorar clinicamente folr1 usando abordagens baseadas em anticorpos para engajar células de efeito imunológico e conjugados de anticorpos (ADC) para cânceres de ovário e mama10,11.
Neste artigo de métodos, clonamos, expressamos e purificamos o anti-FOLR1 clínico (farletuzumab) juntamente com outros anticorpos de controle usando o sistema de expressão CHO. O isótipo IgG1 e um anticorpo clínico anti-idiotype mucin-16 chamado abagovomab12 foram usados como controles negativos. Após a purificação da proteína A, os anticorpos indicados foram rotulados com IRDye 800CW e foram administrados na veia traseira de camundongos nus, com xenoenxertos de tumor ovariano ou FOLR1 humanos transfectados com facadas expressando xenoenxertos de câncer de cólon murino. A localização de anticorpos foi rastreada por imagens ao vivo usando espectro de imagem in vivo em vários pontos de tempo diferentes7. Este método não requer qualquer modificação genética ou injeção do substrato para permitir a emissão de luz e é significativamente mais rápido, econômico e eficiente. O protocolo geral de clonagem, expressão, purificação e rotulagem descrito abaixo pode ser aplicado a qualquer anticorpo clínico e não clínico se as sequências de cadeia pesada e leve estiverem disponíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
A entrega específica do tecido seletivo e tumoral de agente terapêutico anticâncer é a chave para medir a eficácia e a segurança de uma determinada terapia-alvo13. Aqui descrevemos uma abordagem rápida e eficiente para investigar a distribuição detalhada de tecidos e tumores de anticorpos clínicos, farletuzumabe e um anticorpo BaCa não clínico. A abordagem descrita é aplicável a qualquer anticorpo recém-gerado e pode ser usada juntamente com um anticorpo clinicamente eficaz (com qua…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Centro de Câncer da Universidade da Virgínia, ao Centro de Análise Biomolecular, ao Centro Avançado de Microscopia e ao Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S é um investigador de carreira em início de carreira da Academia de Câncer de Ovário (OCA-DoD). Este trabalho foi apoiado pela subvenção do NCI/NIH (R01CA233752) para J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) prêmio de financiamento nível-1 para J. T-S (BC17097) e prêmio de financiamento do Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (OCRP) dos EUA (OC180412) para J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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