Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at studere in vivo lokalisering af antistoffer i mus tumor xenograft modeller.
Abstract
Monoklonale antistoffer er høj affinitet multifunktionelle lægemidler, der arbejder ved variable uafhængige mekanismer til at fjerne kræftceller. I løbet af de sidste par årtier, inden for antistof-drug konjugater, bispecifikke antistoffer, kimære antigen receptorer (CAR) og kræft immunterapi har vist sig som det mest lovende område af grundlæggende og terapeutiske undersøgelser. Med talrige vellykkede menneskelige forsøg rettet mod immun checkpoint receptorer og CAR-T celler i leukæmi og melanom i et gennembrud tempo, det er meget spændende tider for onkologisk terapi stammer fra variationer af antistof engineering. Desværre, et betydeligt stort antal antistof og CAR baseret terapeutiske har også vist sig skuffende i menneskelige forsøg med fast kræft på grund af den begrænsede tilgængelighed af immun effektor celler i tumorsengen. Vigtigere, uspecifik fordeling af terapeutiske antistoffer i andre væv end tumorer også bidrage til manglen på klinisk effekt, associeret toksicitet og klinisk svigt. Som trofast oversættelse af prækliniske undersøgelser i humane kliniske stier er stærkt afhængige af mus tumor xenograft effekt og sikkerhedsundersøgelser, her fremhæver vi en metode til at teste tumor og generelle væv fordeling af terapeutiske antistoffer. Dette opnås ved at mærke protein-A renset antistof med nær infrarød fluorescerende farvestof efterfulgt af levende billeddannelse af tumorbærende mus.
Introduction
FDA godkendte det første monoklonale antistof rettet mod CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de næste tyve år, har der været en hurtig eksplosion inden for antistof teknik på grund af den overvældende succes antistoffer mod immun checkpoint hæmmere3. Ved siden af indirekte aktivering af immunsystemet, antistoffer er rettet mod direkte flag kræftceller til præcist at engagere immun effektor celler, udløse cytotoksicitet via død receptor agonist, blokere tumor celle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vækst af blodkar), begrænse immun checkpoint regulatorer, levere radioisotoper, kemoterapi narkotika og siRNA som en konjugerede agenter2. Desuden er undersøgelse af enkeltkædede variable fragmenter (scFv) af forskellige antistoffer på overfladen af patientbaserede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et hurtigt voksende område af kliniske undersøgelser for cellebaserede behandlinger4.
Den ultra-høje affinitet af antistof-baserede lægemidler, der giver selektivitet til antigen udtrykke tumorceller gør det til et attraktivt middel. Ligeledes, den målrettede levering og tumor fastholdelse af et terapeutisk antistof (eller et kemisk stof) er nøglen til at afbalancere effekten over toksicitet. Derfor, et stort antal protein engineering baserede strategier, der omfatter, men er ikke begrænset til bisspecifikke5 og tri-specifikke antistoffer6 bliver udnyttet til væsentligt at øge ivrighed optimeret tumor tilbageholdelse af intravenøst (IV) injiceret terapeutiske5,7. Her beskriver vi en simpel fluorescens-baseret metode til at løse tumor og væv fordeling af potentielt effektive anti-cancer antistoffer.
Fordi animalsk væv besidder auto-fluorescens, når ophidset i synlige spektrum, antistofferne blev oprindeligt mærket med nær infrarød farvestof (f.eks IRDye 800CW). For proofs of concept undersøgelser, har vi gjort brug af folat receptor alpha-1 (FOLR1) rettet mod antistof kaldet farletuzumab og dens afledte kaldet Bispecific anker Cytotoksicitet aktivator (BaCa)7 antistof, der co-mål FOLR1 og død receptor-5 (DR5)8 i en rekombinant antistof. FOLR1 er en veldefineret overexpressed target receptor i æggestokkene og TNBC kræftceller, tumor xenografts og patient tumorer9. Især er der flere bestræbelser på klinisk at udnytte FOLR1 ved hjælp af antistof-baserede tilgange til at engagere immun effektor celler og antistof stof konjugater (ADC) for kræft i æggestokkene og brystkræft10,11.
I denne metode papir, vi klonede, udtrykt og renset klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrol antistoffer ved hjælp af CHO ekspressionssystem. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistof kaldet abagovomab12 blev anvendt som negative kontroller. Efter protein-A rensning, ingavede antistoffer blev mærket med IRDye 800CW og blev administreret i halen vene af nøgne mus enten forsynet ovarietumor xenografter eller stabilt transficeret humant FOLR1 udtrykke murine tyktarmskræft xenografts. Antistoflokaliseringen blev sporet af live imaging ved hjælp af in vivo-billeddannelsesspektrum på flere forskellige tidspunkter7. Denne metode kræver ikke nogen genetisk modifikation eller injektion af substratet for at muliggøre lysemission og er betydeligt hurtigere, omkostningseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, ekspressions-, rensnings- og mærkningsprotokol, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistof, hvis der findes tunge og lette kædesekvenser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv og tumorvæv specifik levering af anti-cancer terapeutisk middel er nøglen til at måle effekten og sikkerheden af en given målrettet behandling13. Her har vi beskrevet en hurtig og effektiv tilgang til at undersøge den detaljerede væv og tumor fordeling af kliniske, farletuzumab og en ikke-klinisk BaCa antistof. Den beskrevne tilgang gælder for alle nygenererede antistof og kan bruges sammen med et klinisk effektivt antistof (med ønskede kvaliteter) for dets tumor / organ fordeling…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolekylær Analyse Facility, Advanced Mikroskopi Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere investigator af kræft i æggestokkene Academy (OCA-DoD). Dette arbejde blev støttet af NCI / NIH tilskud (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gennembrud niveau-1 tildeling til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering tildeling (OC180412) til J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
