Her beskriver vi en enkel og tilgængelig strategi for visualisering, kvantificering og kortlægning af immunceller i formalin-faste paraffin-indlejrede tumorvævsektioner. Denne metode kombinerer eksisterende billedbehandlings- og digitale analyseteknikker med det formål at udvide multipleksingkapaciteten og multiparameteranalysen af billeddiagnostiske analyser.
Immunlandskabet i tumormikromiljøet (TME) er en afgørende faktor i kræftprogression og respons på terapi. Specifikt har tætheden og placeringen af immunceller i TME vigtige diagnostiske og prognostiske værdier. Multiomic profilering af TME har eksponentielt øget vores forståelse af de mange cellulære og molekylære netværk, der regulerer tumor indledning og progression. Disse teknikker indeholder dog ikke oplysninger om den rumlige organisation af celler eller cellecelleinteraktioner. Overkommelige, tilgængelige og nemme at udføre multiplexing teknikker, der tillader rumlig opløsning af immunceller i væv sektioner er nødvendige for at supplere encellede high-throughput teknologier. Her beskriver vi en strategi, der integrerer seriel billedbehandling, sekventiel mærkning og billedjustering for at generere virtuelle multiparameterdias af hele vævssektioner. Virtuelle slides analyseres efterfølgende på en automatiseret måde ved hjælp af brugerdefinerede protokoller, der muliggør identifikation, kvantificering og kortlægning af cellepopulationer af interesse. Billedet analyse er gjort, i dette tilfælde ved hjælp af analysemoduler Tissuealign, Forfatter, og HISTOmap. Vi præsenterer et eksempel, hvor vi anvendte denne strategi med succes til en klinisk prøve, maksimere de oplysninger, der kan opnås fra begrænsede vævsprøver og giver et upartisk billede af TME i hele vævssektionen.
Kræft udvikling er resultatet af en multistep proces, der involverer gensidige interaktioner mellem maligne celler og TME. Andre end tumorceller, TME er sammensat af nonmaligne celler, stromale celler, immuncellepopulationer, og ekstracellulære matrix (ECM)1. Den rumlige organisation af de forskellige cellulære og strukturelle komponenter i tumorvævet og den dynamiske udveksling mellem kræft og tilstødende ikke-kræftceller i sidste ende modulere tumor progression og respons på terapi2,3,4. Det har vist sig, at immunresponset i kræft er spatiotemporally reguleret5,6. Forskellige immuncellepopulationer, der infiltrerer den neoplastiske læsion og det tilstødende væv, udviser karakteristiske rumlige fordelingsmønstre og forskellige aktiverings- og differentieringstilstande forbundet med forskellige funktioner (f.eks. pro- versus antitumor). Disse forskellige immunpopulationer og deres parametre skaber overarbejde med tumoren og de stromale rum.
Fremkomsten af teknologier, der tillader encellede multiomics profilering har eksponentielt øget vores forståelse af de mange cellulære og molekylære netværk, der regulerer carcinogenese og tumor progression. De fleste analyseværktøjer med høj gennemløb kræver imidlertid vævsforstyrrelser og isolation af en enkelt celle, hvilket resulterer i tab af oplysninger om den rumlige organisation af celler og cellecelleinteraktioner7. Da placeringen og placeringen af specifikke immunceller i TME har diagnostisk og prognostisk værdi, er teknologier, der muliggør rumlig opløsning, et vigtigt supplement til encellede immunprofileringsteknikker.
Traditionelt har billeddannelsesteknikker som immunhistokemi (IHC) og multiplex immunfluorescens (mIF) været begrænset til et lille antal biomarkører, der kan visualiseres samtidigt. Denne begrænsning har hæmmet studiet af spatiotemporal dynamik tumor-infiltrerende immunceller, som typisk er defineret af flere fænotypiske markører. De seneste fremskridt inden for billedbehandling og analytiske værktøjer har udvidet mulighederne for multipleksing. Nye antistofbaserede mærkningsteknologier som histocytometri og billeddannelse af massecytometri er blevet anvendt til rumligt at adskille op til henholdsvis 12 og 32 biomarkører, henholdsvis 8,9. Massespektrometri imaging, en teknik, der ikke kræver mærkning, har potentiale til at billedet tusindvis af biomarkører samtidigt i et enkelt væv afsnit10,11. Selv om disse teknikker allerede har vist et stort potentiale for at dissekere vævsimmunlandskabet i kræft, bruger de meget sofistikeret og dyrt udstyr og software og er ikke umiddelbart tilgængelige for de fleste forskere.
Alternativt er multipleksing evnen til traditionelle IHC og mIF blevet udvidet ved hjælp af seriel billeddannelse, sekventielle runder af mærkning, og spektral billeddannelse7,12,13,14,15,16. Disse teknikker genererer flere billeder fra samme eller fra seriel væv sektioner, der kan konsolideres i virtuelle multiparameter dias ved hjælp af billedanalyse software. Derfor øges antallet af markører, der kan visualiseres og analyseres samtidigt.
Her foreslår vi en strategi for rationel tæring af vævsmultiplex-analyser ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser, kopiudstyr til overkommelige beløb og brugervenlig software (figur 1). Denne metode integrerer seriel billeddannelse, sekventiel multiplex mærkning, hele væv simaging, og væv tilpasning til at generere virtuelle multiparameter dias, der kan bruges til automatiseret kvantificering og kortlægning af immunceller i væv sektioner. Ved hjælp af denne strategi, skabte vi en virtuel dias bestående af 11 biomarkører plus to hyppigt anvendte histologiske pletter: hematoxylin og eosin (H & E) og picrosirius rød (PSR). Flere immuncellepopulationer blev identificeret, placeret og kvantificeret i forskellige vævsrum, og deres rumlige fordeling blev løst ved hjælp af vævsheatmaps. Denne strategi maksimerer de oplysninger, der kan opnås fra begrænsede kliniske prøver og gælder for formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) arkiverede vævsprøver, herunder hele væv, kernenålbiopsier, og vævsmikroarrays. Vi foreslår denne metode som en nyttig vejledning til at designe brugerdefinerede analyser til identifikation, kvantificering og kortlægning af immuncellepopulationer i TME.
Enkel, tilgængelig og nem at udføre multiplexing teknikker, der tillader rumlig opløsning af immunceller i væv sektioner er nødvendige for at kortlægge immunlandskabet i kræft og andre immunologiske lidelser. Her beskriver vi en strategi, der integrerer bredt tilgængelige mærknings- og digitale analyseteknikker for at udvide multiplexing-kapaciteten og flerdimensional vurdering af billeddiagtorer12,13,17,19. Farvning af tre serielle sektioner til forskellige markører, og genbrug af sektioner gennem stripning og reprobing teknikker, gjorde det muligt for os at visualisere 11 parametre ud over H & E og PSR pletter. Seks billeder fra disse sektioner blev justeret på en automatiseret måde ved hjælp af væv justering modul. Justeringen var præcis på det individuelle celleniveau for billeder, der stammer fra samme sektion og meget konkordans for billeder, der stammer fra tilstødende sektioner. Virtuel multipleksing gjorde det muligt for os at bestemme, hvordan markører visualiseret i en sektion relatererumsligt til markører visualiseret i en anden sammenhængende sektion. Mens nogle af de farvninger mærket COI’er, andre mærket TCs, giver os mulighed for at kvantificere cois i de forskellige tcs. Brugen af softwareværktøjer til automatiseret kvantificering af COI’er forenklede og fremskyndede i høj grad behandlingen af billeder. Desuden blev der anvendt digital analyse på hele vævssektioner i stedet for udvalgte synsfelter, hvilket resulterede i en upartisk repræsentation af TME. Da vævkoordinaterne for COI’er blev registreret, var det desuden muligt at generere vævsheatmaps.
Der er flere områder i denne protokol, hvor der kan være behov for fejlfinding. For det første kan dårlig antigenudtagning påvirke kvaliteten af mIF, og typen af antigenudtagningsbuffer og varighed bør derfor optimeres for de specifikke assay-/biomarkørbetingelser, der anvendes. For det andet bør den anvendte type blokeringsopløsning tilpasses væv/antigen/arter af primære og sekundære antistoffer. I vores hænder, tilsætning af 10% samlede serum fra de arter, hvor vævet kommer fra blokerede Fc receptorer, og dermed reduceret uspecifik antistof bindende. Tilsætning af 10% serum fra arten de sekundære antistoffer blev rejst i ville minimere direkte uspecifik fastgørelse af sekundære antistoffer til vævssektionen. For det tredje er det vigtigt at validere de primære og sekundære antistoffers specificitet ved hjælp af de korrekte positive og negative kontroller. For det fjerde er øget autofluorescens i nogle kanaler og diffusion af DAPI ved primær antistofstripning også almindelig. For at løse den forbedrede autofluorescens brugte vi primære/sekundære antistofpar, hvor det specifikke signal havde intensitetsværdier mindst 5x baggrundsværdien. Endelig kan nogle højaffinitet antistoffer ikke elueres med regelmæssige stripping procedurer. I dette tilfælde anbefaler vi at bruge sådanne antistoffer i den sidste runde af mærkning. Brugeren kan have til at prøve forskellige farvning sekvenser for at finde den optimale konfiguration for antistoffer af interesse. Effektiviteten af stripningbør bekræftes, før der går videre til en anden eller tredje runde af mærkningen.
Den største begrænsning og udfordring ved denne strategi er at finde de rigtige kombinationer af primære og sekundære fluorescerende antistoffer til markører af interesse. At finde primære antistoffer, der er opdrættet i forskellige arter eller med forskellige isotyper, og som kan anvendes samtidigt, begrænses af, hvad der er kommercielt tilgængeligt. De fleste hele diasscannere er udstyret med lamper og filtre, der tillader billeddannelse maksimalt fem kanaler, og sekundære antistoffer i den rigtige art og højre fluorophore er ikke altid tilgængelige. Vi overvandt delvist disse begrænsninger ved hjælp af serielle farvninger og sekventiel mærkning. Det kan være nødvendigt at teste flere antistofkombinationer for at nå frem til den bedste kombination for de markører, der er interessante. En anden begrænsning er kvaliteten af DAPI farvning, fordi stripning og reprobing ikke altid tillader at udføre kerner segmentering.
Vævet tilpasse modul kræver minimal uddannelse og ingen programmering færdigheder fra brugerne. Softwaren teoretisk tillader tilpasning af et ubegrænset antal billeder. Men præcis tilpasning afhænger af beslægtede sektioner, hvor tættere sektioner, der er mere histologisk konkordans er mere præcist afstemt. Vi brugte author-modulet i VIS til at generere ApPs. Grundlæggende viden om billedanalyse er nødvendig for at skabe APPs, men det er også tilfældet, når du bruger andre billedanalyse software. De unikke fordele ved VIS i forhold til andre billedanalysesoftware omfatter automatiseret justering af billeder fra sektioner, der er udarbejdet ved hjælp af forskellige metoder (f.eks. Dette giver mulighed for colocalization undersøgelser af flere markører af interesse ved hjælp af virtuelle multiplexing. Desuden giver det fleksible og brugervenlige design af AOP’er mulighed for brugerspecifik tilpasning. Automatiseret kvantificering og kortlægning, og muligheden for behandling af hele vævsektioner, sparer tid og reducerer bias sammenlignet med manuel optælling ved visuel inspektion.
Denne strategi er et meget nyttigt forskningsværktøj til vævimmunologi i forbindelse med kræft og autoimmunitet, men forbliver ikke valideret til klinisk brug. Med yderligere standardisering og validering, kan det bruges i fremtiden til flere anvendelser (f.eks at kortlægge immunlandskabet i kræft til at forudsige og overvåge reaktionen på immunterapeutiske midler). Det kan også tilpasses forskellige inflammatoriske tilstande (f.eks. inflammatorisk tarmsygdom) for at kombinere patologisk evaluering med prognostiske biomarkører.
De vigtigste kritiske trin i denne protokol er mærkningens effektivitet/specificitet og de konstruerede AOP’ers robusthed til den tilsigtede anvendelse eller biomarkør. Derfor er regelmæssig validering ved visuel inspektion, især ved at designe en ny APP, afgørende. Effektiv brug af flere runder af stripning og reprobing eller forskellige typer af pletter på samme sektion er kritiske komponenter og kan være væv eller afsnit specifikke. Det er vigtigt at kontrollere effektiviteten af sådanne processer, før du fortsætter med en stor batchanalyse.
Sammenfattende giver vi en strategi, der maksimerer de kvantitative og rumlige oplysninger, der kan opnås fra værdifulde kliniske vævsprøver. De ressourcer, det udstyr og den viden, der er nødvendig for at gennemføre denne metode, er bredt tilgængelige. Vi foreslår denne metode som en nyttig vejledning til planlægning af analyser, der har til formål at identificere, kvantificere og kortlægge immuncellepopulationer i TME.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker studiedeltageren. Vi takker Louise Rousseau, koordinator for HBP-biobanken for genvinding af vævsprøverne og alle tilknyttede kliniske oplysninger. Vi anerkender den molekylære patologi og celle imaging kernefaciliteter på CRCHUM og Michael Persch fra Visiopharm for fremragende teknisk bistand. Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) og Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC). CanHepC er finansieret af et fælles initiativ fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) og Public Health Agency of Canada. M.F.M. modtog stipendier fra Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis og FRQS. T.F. modtog ph.d.-stipendier fra CIHR og CanHepC. ST holder Roger-Des-Groseillers stol i hepatobiliary og pancreas onkologisk kirurgi, Université de Montréal.
Forfatterbidrag: M.F.M. designet, udført eksperimenter, og analyserede data. T.F. designede eksperimenter. A.C-B. teknisk vejledning. G.S. udførte alle de patologiske vurderinger af forsøgspersonen og gav input til alle de patologiske aspekter. L.M. udførte H&E-farvning, optimeret og udført billedanskaffelse. M.N.A. udførte PSR-pletten og leverede værdifulde tekniske input. N.B. bidrog til billedanalysen. S.T. er hovedinvestigator for HBP-biobanken og er ansvarlig for at føre tilsyn med biobankens samlede drift. Han gav også uvurderlige input om alle aspekter af projektet og dets kliniske konsekvenser. M.F.M. T.F., og N.H.S. konceptualiseret og designet undersøgelsen. N.H.S. overvågede arbejdet og opnåede finansiering. M.F.M., T.F., A.C-B og N.H.S. skrev manuskriptet. Alle forfattere gennemgik og godkendte manuskriptet.
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Ethanol 100% | |||
Electric pressure cooker | Salton | ||
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
FFPE section (4μm) slides | |||
Glycine 0,1 M in PBS | |||
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
Human Serum | Gemini | 22210 | |
Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
Pap pen | abcam | ab2601 | |
PBS | |||
PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Shaking water bath | |||
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
VIS Software | Visiopharm | ||
Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |