청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑
Summary
Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.
Abstract
신경 회로를 조사할 때, 시험관 내 패치 클램프 접근법의 표준 제한은 여러 소스의 축슨이 종종 혼합되어 전기 자극을 가진 개별 소스로부터 입력을 분리하는 것을 어렵게 만드는 것입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)을 사용하여, 이러한 한계는 이제 극복 할 수있다. 여기에서, 우리는 낮은 청각 뇌간 핵및 commissural 입력에서 청각 시스템의 중간 뇌 핵인 열등한 콜리큘러스 (IC)에 있는 신경의 확인된 부류에 오름차순 입력을 지도로 하기 위하여 CRACM를 이용하는 방법을 보고합니다. IC에서, 로컬, 커미션, 오름차순 및 내림차순 축색은 무겁게 얽혀 있고 따라서 전기 자극과 구별할 수 없습니다. 시냅스 핵에서 채널로덕신의 발현을 유도하기 위해 바이러스 성 구조를 주입하고, 패치 클램프 기록을 이어서 채널로도셉신 발현 시냅스 입력, 특정 소스로부터의 프로젝션의 존재 및 생리학을 특성화한다. IC 뉴런의 특정 집단에 세포 유형별 정확도로 매핑될 수 있다. 이 접근법은 청색 광 활성화 채널러도셉신인 크로노스와 적색 채널로도이프신인 ChrimsonR과 함께 작동한다는 것을 보여줍니다. 전뇌의 이전 보고서와는 달리, 우리는 ChrimsonR이 등지 달팽이관 핵 주요 뉴런의 축축을 강력하게 인신 매매하고 있음을 발견하며, 이는 ChrimsonR이 뇌간 CRACM 실험에 유용한 도구가 될 수 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 쥐의 등쪽 달팽이관 핵 및 IC에 주사를 표적으로 하는 입체 좌표를 포함하여 두개내 바이러스 주사 수술에 대한 자세한 설명과 전체 세포 패치 클램프 기록을 결합하는 방법 등이 포함되어 있습니다. IC 뉴런에 대한 장거리 프로젝션을 조사하기 위해 채널로도셉신 활성화를 통해 이 프로토콜은 IC에 청각 입력을 특성화하는 데 맞춤화되어 있지만, 청각 뇌간 및 그 너머의 다른 장거리 예측을 조사하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
Introduction
시냅스 연결은 신경 회로 기능에 매우 중요하지만, 신경 회로 내의 시냅스의 정확한 토폴로지와 생리학은 종종 실험적으로 조사하기가 어렵습니다. 이는 세포 전기 생리학의 전통적인 도구인 전기 자극이 자극 부위 근처의 축사를 무차별적으로 활성화하고 대부분의 뇌 영역에서 다른 소스(로컬, 오름차순 및/또는 내림차순)의 축축을 서로 연결하기 때문입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)1,2를사용하여, 이러한 제한은 이제3을극복 할 수있다 . 채널로도셉신(ChR2)은 원래 녹색 조류 클라미도모나스 린하르트티에서발견되는 광 활성화, 양이온 선택적 이온 채널이다. ChR2는 450-490 nm 의 파장의 청색광에 의해 활성화될 수 있으며, 양이온 유입을 통해 세포를 탈분극화할 수 있다. ChR2는 먼저 나겔과 동료4에의해 제노푸스 oocytes에서 설명하고 표현되었다. 그 직후, Boyden과 동료5 포유류 뉴런에서 ChR2를 표현하고 그들이 안정적으로 밀리 초 타임 스케일에 스파이크를 제어하는 광 펄스를 사용할 수 있음을 보여 주었다, 블루 라이트와 ChR2의 활성화 후 ~ 10 ms 행동 전위를 유도. 더 빠른 역학을 가진 광유전학 채널은 최근에 발견되었습니다 (예를 들어, 크로노스6).
CRACM 실험에 대한 기본적인 접근법은 채널로도프신에 대한 유전 정보를 전달하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)로 가설전전 시냅스 뉴런의 집단을 트랜스펙트하는 것이다. rAAV를 가진 뉴런의 형질감염은 인코딩된 채널로도프신의 발현을 이끈다. 전형적으로, 채널로집신은 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 tdTomato (적색 형광 단백질) 같이 형광 단백질로 꼬리표를 붙입니다, 그래서 표적 지구에 있는 신경의 형질감염은 형광 화상 진찰로 쉽게 확인될 수 있습니다. rAAV는 비병원성이기 때문에, 낮은 염증 전위 및 오래 지속되는 유전자발현7,8,그들은 뉴런에 채널로도신을 전달하는 표준 기술이 되었다. 만약, 뉴런의 시냅스 전 형질전환 후, 빛 깜박임을 통한 채널로도냅신의 활성화가 표적 뉴런의 후통 전위 또는 전류를 유도하는 경우, 이것은 형질전환된 핵에서 기록된 세포로의 축삭 연결의 증거이다. 뇌 슬라이스 실험에서 절단 된 축삭은 channelrhodopsin 활성화를 통해 신경 전달 물질을 방출하도록 구동 될 수 있기 때문에, 급성 슬라이스의 외부에 놓여 있지만 후시 냅스 뇌 영역으로 축삭을 보내는 핵은 CRACM으로 식별 할 수 있습니다. 이 기술의 힘은 확인 된 장거리 시 냅 스 입력의 연결 및 생리 직접 조사 될 수 있다.
청색광에 의해 흥분되는 channelrhodopsins 이외에, 조사자는 최근에 Chrimson및 그것의 더 빠른 아날로그 ChrimsonR를 포함하여 몇몇 적색 이동 채널로도실9,10를확인했습니다, 둘 다 ~ 660 nm6의빨간 빛으로 흥분됩니다. 적색시프트 옵신은 청색광보다 조직에 더 잘 침투하기 때문에 관심의, 적색광은청색광(10,11,12)보다세포독성이 낮을 수 있다. 적색 이동 채널러도프신은 또한 동일한 뉴런상에 상이한 핵으로부터 축세포의 수렴이 하나의실험6,13,14에서시험될 수 있는 이중색 CRACM 실험의 가능성을 열어주어있다. 그러나, 현재 적색 이동 opsins 종종 블루 라이트와 원치 않는 교차 활성화를 전시15,16,17,두 가지 색상 실험을 어렵게 만들기. 또한, 일부 보고서는 ChrimsonR이 제한된 축산 인신 매매를 겪고 있음을 지적했으며, 이는 CRACM 실험16,17에ChrimsonR을 사용하기가 어려울 수 있습니다.
하부 청각 뇌간 핵에서 거의 모든 오름차순 예측은 열등한 콜리큘러스 (IC)에 수렴, 중앙 청각 통로의 중뇌 허브. 이는 달팽이관 핵(CN)18,19,대부분의 우수한 올리바리 복합체(SOC)20,및 측면 lemniscus21의등쪽(DNLL) 및 복부(VNLL) 핵으로부터의 투영을 포함한다. 부가적으로, 청각 피질로부터의 큰 내림차순 투영은 IC18,19,20,21,22,및 IC 뉴런 자체가 IC23의국소 및 반대측 엽 내에서 광범위하게 시냅스로 종료된다. 많은 소스에서 축색의 혼합은 전기 자극(24)을사용하여 IC 회로를 프로브하기 어렵게했다. 그 결과, IC 내의 뉴런들이 건전한 국소화 및 음성 및 기타 통신소리의 식별에 중요한 계산을 수행하더라도25,26,IC 내의 신경 회로의 조직은 크게 알려지지 않았다. 우리는 최근에 IC27에있는 첫번째 분자로 식별가능한 뉴런 으로 VIP 뉴런을 확인했습니다. VIP 뉴런은 청각 시상및 우수한 콜리큘러스를 포함한 여러 장거리 표적에 투영되는 글루타마테르이트 성세포 뉴런이다. 이제 VIP 뉴런에 대한 로컬 및 장거리 입력의 소스와 기능을 결정하고 이러한 회로 연결이 사운드 처리에 어떻게 기여하는지 확인할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 마우스의 IC에서 VIP 뉴런에 대한 시냅스 입력을 조사하기 위해, 특히 반대쪽 IC 및 DCN(그림1)에서맞춤화된다. 프로토콜은 입력의 다른 근원, 다른 신경 모형 또는 전부 다른 두뇌 지구에 쉽게 적응될 수 있습니다. 우리는 또한 ChrimsonR청각 뇌간에서 장거리 회로 매핑을위한 효과적인 적색 이동 채널로도프신임을 보여줍니다. 그러나 ChrimsonR은 낮은 강도에서도 청색광에 의해 강력하게 활성화되어 있으므로 ChrimsonR과 크로노스를 2가지 색상의 CRACM 실험에서 결합하기 위해서는 ChrimsonR의 교차 활성화를 방지하기 위해 신중한 컨트롤을 사용해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 CRACM이 마우스 IC에 있는 뉴런에 장거리 시냅스 입력을 확인하고 특성화하기 위한 강력한 기술이다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 DCN 및 IC에서 뉴런의 강력한 트랜스펙션뿐만 아니라 IC의 시냅스 터미널에 크로노스와 ChrimsonR의 신뢰할 수있는 축산 인신 매매를 달성했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 PSP 진폭, 하프 폭, 부패 시간 및 수용체 약리…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 도이치 Forschungsgemeinschaft 연구 펠로우십 (GO 3060/1-1, 프로젝트 번호 401540516, DG) 및 국립 보건 원부 R56 DC016880 (MTR)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
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