JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.

Abstract

Het haarcel mechanotransduct (MET) kanaal speelt een belangrijke rol bij het horen. De moleculaire identiteit en structurele informatie van de met a.r.v. Elektrofysiologische studies van haarcellen bleek dat de MET kanaal heeft een grote geleiding en is doorlaatbaar om relatief grote fluorescerende kationische moleculen, waaronder sommige styryl kleurstoffen en Texas Red-gelabeldaminoglycoside antibiotica. In dit protocol beschrijven we een methode om de opname van fluorescerende dextrans in haarcellen van het orgaan van Corti-explants te visualiseren en te evalueren, die kunnen worden gebruikt om te zien voor functionele MET-kanalen. We vonden dat 3 kDa Texas Red-gelabeldd dextran specifiek labels functionele auditieve haarcellen na 1-2 uur incubatie. In het bijzonder labelt 3 kDa dextran de twee kortere stereociliarijen en hoopt zich op in het cellichaam in een diffuus patroon wanneer functionele MET-kanalen aanwezig zijn. Een extra blaasachtig patroon van etikettering werd waargenomen in het cellichaam van haarcellen en omringende ondersteunende cellen. Onze gegevens suggereren dat 3 kDa Texas-Red dextran kan worden gebruikt om te visualiseren en te bestuderen twee trajecten voor cellulaire kleurstof opname; een haarcelspecifieke toegangsroute via functionele MET-kanalen en endocytose, een patroon dat ook beschikbaar is voor grotere dextran.

Introduction

De haarcellen van het binnenoor zijn de sensorische cellen die geluid detecteren en de mechanisch stimuli in elektrische signalen bedekken, die uiteindelijk door onze hersenen worden geïnterpreteerd. Deze cellen hebben een trapvormige bundel van drie rijen actine-gebaseerde filamenten, bekend als stereocilia, die uitsteken uit hun apicale gebied1,2. De mechanische stimuli buigen de stereocilia filamenten naar de langste rij en leiden tot de opening van de mechanotransductie (MET) kanalen3. De opening van de MET-kanalen leidt tot een toestroom van kationen die de cel depolariseert en dus het vrijkomen van synapsblaasjes in het basale gebied van de haarcel signaleert.

De biofysische eigenschappen van het MET-kanaal dat essentieel is voor het gehoor zijn uitgebreid gekarakteriseerd. Deze kanalen zijn onder andere selectief en hebben een relatief grote geleiding (150-300 pS in lage Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Opmerkelijk is dat grote fluorescerende moleculen zoals FM1-43 en Texas Red-gelabelde aminoglycosiden permeant blockers van het MET-kanaal zijn, wat resulteert in hun accumulatie in het haarcellichaam dat kan worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie11,12,13,14. Omgekeerd zijn de moleculaire identiteit en de structuur van het MET-kanaal en het permeatietraject ongrijpbaar gebleven. Steeds meer experimenteel bewijs wijst erop dat het transmembraanachtige kanaaleiwit 1 (TMC1) een onderdeel is van het MET-kanaal in volwassen haarcellen15,16,17,18,19. Mutaties in het transmembraanachtige kanaal 1 (TMC1) veranderen de EIGENSCHAPPEN van het MET-kanaal19,20,21,22 en veroorzaken doofheid. Daarnaast lokaliseert TMC1 naar de site van het MET-kanaal18,23 en werkt hij samen met de tip-link die verantwoordelijk is voor het overbrengen van de mechanische kracht naar het MET-kanaal24,25. Bovendien heeft de recente bio-informaticaanalyse de TMC-eiwitten geïdentificeerd als evolutionair gerelateerd aan de mechanogevoelige kanalen TMEM63/OSCA-eiwitten en de TMEM16-eiwitten, een familie van calciumgeactiveerde chloridekanalen en lipidescramblases26,27,28. Een structureel model van TMC1 op basis van de relatie tussen deze eiwitten bleek de aanwezigheid van een grote holte op de eiwit-lipide interface27. Deze holte herbergt de twee TMC1-mutaties die autosomal dominant gehoorverlies veroorzaken (DFNA36)27,29,30,31,32, en selectieve modificatie van cysteïnemutanten voor residuen in de holte veranderen MET-kanaaleigenschappen28, wat aangeeft dat het zou kunnen functioneren als het permeatietraject van het MET-kanaal. De grote omvang van deze voorspelde holte in TMC-eiwitten kan het vermogen van grote moleculen om het MET-kanaal door te dringen verklaren. Om de voorspelling te testen dat het MET-kanaal een ongewoon groot permeatietraject bevat en om de grenzen van de grootte van de holte in TMC1 te verleggen, ontwikkelden we een protocol om opname-experimenten uit te voeren in het orgaan van Corti-explants met een groter molecuul, 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red.

Dextran is een complexe vertakte polysaccharide bestaande uit vele D-glucose moleculen gebonden door alfa-1,6 glycosidische koppelingen. De hoge oplosbaarheid in water, lage celtoxiciteit en bioinertiteit maken het een veelzijdig hulpmiddel om verschillende cellulaire processen te bestuderen. Daarnaast is dextran verkrijgbaar in een breed scala van maten en fluorescerend gelabeld met fluorophores van verschillende kleuren. Fluorescerend gelabeldde dextrans worden vaak gebruikt in cel- en weefseldoorlaatbaarheidsonderzoek33,34, om endocytose te bestuderen in meerdere cellulaire systemen35,36, en voor neurale tracering37,38. In het auditieve veld zijn ook dextran moleculen gebruikt om de verstoring van de celcelverbinding en het verlies van de auditieve sensorische epitheelintegriteit te beoordelen na blootstelling aan intens geluid in het chinchilla-orgaan van Corti39,40.

In dit werk, we benut de eigenschappen van enkele van de kleinste (3 en 10 kDa) fluorescerende dextrans om opname-experimenten uit te voeren in murine binnenoor haarcellen en verken de grootte van de permeatie pad van het binnenste oor haarcel MET kanaal. Daarnaast gebruikten we een laser-scanning confocale microscoop (LSM) 880 uitgerust met een Airyscan detector te visualiseren en lokaliseren fluorescerende dextran op de stereocilia en de cel lichaam van auditieve haarcellen.

Protocol

De dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, die werden goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en -gebruik van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Beroerte (Dierprotocol #1336 kJS). 1. Muizen Stel een paar broedparen van C57BL/6J wild-type om te fokken in de dierlijke faciliteit om de geboortedatum van de nesten te controleren en bijhouden van de leeftijd va…

Representative Results

We zagen robuuste en specifieke etikettering van haarcellen na 2 uur incubatie van orgaan van Corti explants van wilde postnatale-dag-6 (P6) muizen met 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red (dextran-TR) (Figuur 2A-B). Dextran labeling werd waargenomen in zowel binnen- als buitenhaarcellen (IHC en OHC) in de basale, middelste en apicale gebieden van het orgaan van Corti(figuur 2B). Fluores…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe opname-experimenten uit te voeren in murine orgaan van Corti explants met 3 kDa dextran Texas Red. Het doel van deze methode is om te testen of moleculen groter dan anderen eerder getest waren ook in staat om specifiek label auditieve haarcellen en doordringen door de MET kanaal. Soortgelijke experimentele protocollen zijn eerder gebruikt om de doorlaatbaarheid van haarcellen te evalueren naar andere fluorescerende kleurstoffen zoals FM1-43 (0,56 kDa)12,<sup …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Vincent Schram van de NICHD microscopie en beeldvorming kern voor het helpen bij de confocale beeld verwerving, en Tsg-Hui Chang voor onschatbare hulp bij kolonie management en muizen zorg. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, Bethesda, MD, naar K.J.S. A.B. werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, en door een Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship uit het intramurale onderzoeksprogramma van de NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Génétique. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

Keywords: Dextran LabelingLive Hair CellsMechanotransduction ChannelsCochlear DissectionFluorescent Dextran
check_url/fr/60769?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image