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Bio-ingénierie

Etiquetado y toma de Dextran en células de cabello cocleares de murine en vivo y funcionales

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Aquí, presentamos un método para visualizar la toma de 3 kDa Texas Red-labeled dextran en células vellosas auditivas con canales funcionales de mechanotransducción. Además, dextrans de 3-10 kDa se puede utilizar para estudiar la endococitosis en el cabello y las células de soporte del órgano de Corti.

Abstract

El canal de mecanotransducción de células pilosas (MET) desempeña un papel importante en la audición. Sin embargo, la identidad molecular y la información estructural del Met siguen siendo desconocidas. Los estudios electrofisiológicos de las células pilosas revelaron que el canal MET tiene una gran conductividad y es permeable a moléculas catiónicas fluorescentes relativamente grandes, incluyendo algunos tintes de estilo y antibióticos aminoglucósidos etiquetados en rojo de Texas. En este protocolo, describimos un método para visualizar y evaluar la absorción de dextrans fluorescente en células pilosas del órgano de explantas Corti que se puede utilizar para realizar ensayos para canales MET funcionales. Encontramos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran específicamente etiqueta células capilares auditivos funcionales después de 1–2 h de incubación. En particular, 3 kDa dextran etiqueta las dos filas de estereocilia más cortas y se acumula en el cuerpo celular en un patrón difuso cuando los canales MET funcionales están presentes. Se observó un patrón adicional similar a la vesícula de etiquetado en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de soporte circundantes. Nuestros datos sugieren que 3 kDa Texas-Red dextran se puede utilizar para visualizar y estudiar dos vías para la aceptación del tinte celular; una ruta de entrada específica de células capilares a través de canales MET funcionales y endocitosis, un patrón también disponible para mayor demás.

Introduction

Las células pilosas del oído interno son las células sensoriales que detectan el sonido y encubren los estímulos mecánicos en las señales eléctricas, que en última instancia son interpretadas por nuestro cerebro. Estas células tienen un haz en forma de escalera de tres filas de filamentos a base de actina, conocidos como estereocilia, que sobresalen de su región apical1,2. Los estímulos mecánicos desvían los filamentos estereocilia hacia la fila más larga y activan la apertura de los canales3de mechanotransducción (MET). La apertura de los canales MET conduce a una afluencia de cationes que despolariza la célula y, en consecuencia, señala la liberación de vesículas de sinapsis en la región basal de la célula pilosa.

Las propiedades biofísicas del canal MET esenciales para la audición se han caracterizado ampliamente. Entre otras propiedades, estos canales son selectivos catiónicos y tienen una conductancia relativamente grande (150–300 pS en Ca2+bajo)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandes moléculas fluorescentes como FM1-43 y aminoglucósidos etiquetados con Texas Red son bloqueadores permeantes del canal MET, lo que resulta en su acumulación en el cuerpo de la célula pilosa que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia11,12,13,14. Por el contrario, la identidad molecular y la estructura del canal MET y su vía de permeación han permanecido esquivas. El aumento de la evidencia experimental indica que la proteína canal transmembrana 1 (TMC1) es un componente del canal MET en células pilosas maduras15,16,17,18,19. Las mutaciones en el canal transmembrana 1 (TMC1) alteran las propiedades del canal MET19,20,21,22 y causan sordera. Además, TMC1 localiza el sitio del canal MET18,23 e interactúa con el enlace de punta responsable de transmitir la fuerza mecánica al canal MET24,25. Además, el reciente análisis bioinformático ha identificado las proteínas TMC como evolutivas relacionadas con los canales mecanosensibles TMEM63/OSCA y las proteínas TMEM16, una familia de canales de cloruro activados por calcio y escramblas de lípidos26,27,28. Un modelo estructural de TMC1 basado en la relación entre estas proteínas reveló la presencia de una gran cavidad en la interfaz proteína-lípido27. Esta cavidad alberga las dos mutaciones TMC1 que causan pérdida auditiva autosómica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, y la modificación selectiva de mutantes de cisteína para residuos en la cavidad alteran las propiedades del canal MET28, lo que indica que podría funcionar como la vía de permeación del canal MET. El gran tamaño de esta cavidad pronosticada en proteínas TMC podría explicar la capacidad de las moléculas grandes para impregnar el canal MET. Para probar la predicción de que el canal MET contiene una vía de permeación inusualmente grande y para empujar los límites del tamaño de la cavidad observado en TMC1, desarrollamos un protocolo para realizar experimentos de absorción en el órgano de Corti explantes con una molécula más grande, 3 kDa dextran fluorescente etiquetado con Texas Red.

Dextran es un polisacárido ramificado complejo compuesto por muchas moléculas de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,6. Su alta solubilidad en agua, baja toxicidad celular y bioinertidad lo convierten en una herramienta versátil para estudiar varios procesos celulares. Además, dextran está disponible en una amplia gama de tamaños y etiquetado fluorescentemente con fluoróforos de varios colores. El dextrans etiquetado fluorescentemente se utiliza comúnmente en la investigación de permeabilidad celular y tisular33,34, para estudiar la endoctitosis en múltiples sistemas celulares35,36, y para el rastreo neural37,38. En el campo auditivo, las moléculas de desnción también se han utilizado para evaluar la interrupción de la unión celular-célula y la pérdida de la integridad del epitelio sensorial auditivo después de la exposición al ruido intenso en el órgano chinchilla de Corti39,40.

En este trabajo, aprovechamos las propiedades de algunos de los dextrans fluorescentes más pequeños (3 y 10 kDa) para realizar experimentos de absorción en células pilosas del oído interno murina y explorar el tamaño de la vía de permeación del canal MET de la célula del cabello del oído interno. Además, utilizamos un microscopio confocal de escaneo láser (LSM) 880 equipado con un detector Airyscan para visualizar y localizar el deextrano fluorescente en la estereocilia y el cuerpo celular de las células vellosas auditivas.

Protocol

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio, que fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Protocolo Animal #1336 a KJS). 1. Ratones Establecer un par de parejas reproductoras de tipo salvaje C57BL/6J para reproduciren en las instalaciones de animales para controlar la fecha de…

Representative Results

Observamos etiquetado robusto y específico de las células pilosas después de 2h incubación de órgano de explantes de Corti de tipo salvaje postnatal-día-6 (P6) con 3 kDa dextran fluorescentemente etiquetado con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). Se observó etiquetado Deextran tanto en células capilares internas como externas (IHC y OHC) en las regiones basal, media y apical del órgano de Corti(Figura 2B). <p clas…

Discussion

Este protocolo describe cómo realizar experimentos de admisión en órgano murino de los explantes de Corti con 3 kDa dextran Texas Red. El objetivo de este método es probar si las moléculas más grandes que otras previamente probadas también fueron capaces de etiquetar específicamente las células vellosas auditivas y permear a través del canal MET. Protocolos experimentales similares se han utilizado previamente para evaluar la permeabilidad de las células pilosas a otros tintes fluorescentes como FM1-43 (0.56 k…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Vincent Schram del núcleo de microscopía e imágenes NICHD por ayudar en la adquisición de imágenes confocales, y a Tsg-Hui Chang por obtener una ayuda inestimable en la gestión de colonias y el cuidado de ratones. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S.A.B. fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, y por una beca postdoctoral Robert Wenthold del programa de investigación intramuros del NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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Citer Cet Article
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
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