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Bio-ingénierie

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Abstract

O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.

Introduction

As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, consequentemente, sinaliza a liberação de vesículas de sinapse na região basal da célula cilia.

As propriedades biofísicas do canal MET essenciais para a audição foram extensivamente caracterizadas. Entre outras propriedades, esses canais são seletivos cationic e possuem uma realização relativamente grande (150-300 pS em baixa Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Notavelmente, grandes moléculas fluorescentes como aminoglicoglicolados de marca vermelha do Texas são bloqueadores perversos do canal MET, resultando em seu acúmulo no corpo de células ciliadas que podem ser visualizados usando microscopia de fluorescência11,12,13,14. Por outro lado, a identidade molecular e a estrutura do canal MET e seu caminho de permeação permaneceram evasivos. Evidências experimentais crescentes indicam que a proteína do canal transmembrana 1 (TMC1) é um componente do canal MET em células ciliadas maduras15,16,17,18,19. Mutações no canal 1 (TMC1) alteram as propriedades do canal MET19,20,21,22 e causam surdez. Além disso, o TMC1 localiza o site do canal MET18,23 e interage com o tip-link responsável por transmitir a força mecânica para o canal MET24,25. Além disso, a recente análise bioinformática identificou as proteínas TMC como evolutivas relacionadas aos canais mecanosensíveis TMEM63/OSCA e as proteínas TMEM16, uma família de canais de cloreto ativados com cálcio e mexidas lipídicas26,27,28. Um modelo estrutural do TMC1 baseado na relação entre essas proteínas revelou a presença de uma grande cavidade na interface protein-lipídica27. Esta cavidade abriga as duas mutações TMC1 que causam perda auditiva autossômica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e modificação seletiva de mutantes de cisteína para resíduos nas propriedades do canal met da cavidade alter28,indicando que poderia funcionar como o caminho de permeação do canal MET. O grande tamanho dessa cavidade prevista em proteínas TMC poderia explicar a capacidade de grandes moléculas de permear o canal MET. Para testar a previsão de que o canal MET contém um caminho de permeação extraordinariamente grande e para empurrar os limites do tamanho da cavidade observada no TMC1, desenvolvemos um protocolo para realizar experimentos de captação no órgão de explantas corti com uma molécula maior, 3 kDa dextran fluorescente rotulado com Texas Red.

Dextran é um complexo polissacarídeo ramificado composto por muitas moléculas de glicose D amarradas por ligações glicosídicas alfa-1,6. Sua alta solubilidade em água, baixa toxicidade celular e bioinertidade fazem dela uma ferramenta versátil para estudar vários processos celulares. Além disso, o dextran está disponível em uma ampla gama de tamanhos e fluorescentemente rotulado com fluoroforres de várias cores. Dextrans rotulado fluorescente são comumente utilizados na pesquisa de permeabilidade celular e tecidual33,34, para estudar endocitose em múltiplos sistemas celulares35,36, e para rastreamento neural37,38. No campo auditivo, moléculas dextran também têm sido usadas para avaliar a interrupção da junção celular-célula e perda da integridade auditiva sensorial de epitélio após exposição ao ruído intenso no órgão chinchilla de Corti39,40.

Neste trabalho, exploramos as propriedades de algumas das menores (3 e 10 kDa) fluorescentes dextrans para realizar experimentos de captação em células de ouvido internos de murina e explorar o tamanho da via de permeação do canal MET da célula capilar interna do ouvido. Além disso, usamos um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) 880 equipado com um detector de airyscan para visualizar e localizar dextran fluorescente na estereoilia e no corpo celular de células cilias auditivas.

Protocol

Os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados seguindo as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais, que foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (Protocolo Animal #1336 ao KJS). 1. Ratos Coloque um par de pares de c57BL/6J do tipo selvagem para procriar na instalação animal para controlar a data de nascimento das ninhadas e acompanhar a idade dos…

Representative Results

Observamos rotulagem robusta e específica de células ciliadas após 2h de incubação de órgão séti de camundongos pós-parto-6 (P6) do tipo selvagem com 3 kDa dextran fluorescente rotulados com Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). A rotulagem Dextran foi observada em células capilares internas e externas (IHC e OHC) nas regiões basal, média e apical do órgão de Corti (Figura 2B). A phalloi…

Discussion

Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Génétique. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

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Citer Cet Article
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
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