OaAEP1-मध्यस्थता एंजाइमैटिक संश्लेषण और एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए बहुलक प्रोटीन के Immobilization
Summary
यहां, हम एक नियंत्रित अनुक्रम के साथ प्रोटीन बहुलक बनाने एंजाइमों द्वारा प्रोटीन मोनोमर को संजन्य करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं और इसे एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययनों के लिए सतह पर स्थिर करते हैं।
Abstract
हाल के वर्षों में रासायनिक और जैव-संयोजन तकनीकों को तेजी से विकसित किया गया है और प्रोटीन पॉलिमर के निर्माण की अनुमति देता है। हालांकि, एक नियंत्रित प्रोटीन बहुलीकरण प्रक्रिया हमेशा एक चुनौती है। यहां, हमने तर्कसंगत रूप से नियंत्रित अनुक्रम में कदम से बहुलक प्रोटीन कदम के निर्माण के लिए एक एंजाइमैटिक पद्धति विकसित की है। इस विधि में, प्रोटीन मोनोमर का सी-टर्मिनस ओएएईपी 1(ओल्डेंलैंडिया एफिडेनिसिस शतावरील एंडोपेप्टिडेस)1) का उपयोग करके प्रोटीन संयुग्मन के लिए एनजीएल है जबकि एन-टर्मिनस अस्थायी एन-टर्मिनल की रक्षा के लिए एक क्लेवबल टीईवी (तंबाकू etch वायरस) दरार साइट प्लस एक एल (ENLYFQ/GL) था। नतीजतन, OaAEP1 एक समय में केवल एक प्रोटीन मोनोमर जोड़ने में सक्षम था, और फिर TEV प्रोटीज क्यूऔर जी के बीच एन-टर्मिनस cleaved एनएच 2-Gly-Leu बेनकाब करने के लिए । फिर यूनिट अगले OaAEP1 लिगेशन के लिए तैयार है। इंजीनियर पॉलीप्रोटीन की जांच परमाणु बल माइक्रोस्कोपी आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएम-एसएमएफएस) का उपयोग करके व्यक्तिगत प्रोटीन डोमेन का खुलासा करके की जाती है । इसलिए, यह अध्ययन पॉलीप्रोटीन इंजीनियरिंग और स्थिरीकरण के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान करता है।
Introduction
सिंथेटिक पॉलिमर की तुलना में, प्राकृतिक बहु-डोमेन प्रोटीन में एक समान संरचना होती है जिसमें एक अच्छी तरह से नियंत्रित संख्या और उपडोमेन1का प्रकार होता है। इस विशेषता से आमतौर पर जैविक कार्य में सुधार होता है और स्थिरता2,3होती है . साइस्टीन आधारित डिसुल्फिफाइड बॉन्ड कपलिंग और रिकॉम्बिनेंट डीएनए तकनीक जैसे कई दृष्टिकोणों को कई डोमेन4,5,6,7के साथ इस तरह के बहुलीकृत प्रोटीन के निर्माण के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, पूर्व विधि हमेशा एक यादृच्छिक और अनियंत्रित अनुक्रम में परिणाम है, और बाद में एक विषाक्त और बड़े आकार के प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के लिए कठिनाई और कोफैक्टर और अन्य नाजुक एंजाइमों के साथ जटिल प्रोटीन की शुद्धि सहित अन्य समस्याओं की ओर जाता है।
इस चुनौती का सामना करने के लिए, हम एक एंजाइमैटिक विधि विकसित करते हैं जो एक प्रोटीन लिगाज ओएएईपी 1का उपयोग करके एक स्टेपवाइज फैशन में पॉलीमर/पॉलीप्रोटीन के लिए एक साथ प्रोटीन मोनोमर को एक साथ संजोए रखताहै। OaAEP1 एक सख्त और कुशल एंडोपेप्टिडास है। दो प्रोटीन को 30 से कम समय में OaAEP1 द्वारा दो टर्मिनी के माध्यम से Asn-Gly-Leu अनुक्रम (NGL) के रूप में सहसंयोजक के रूप में जोड़ा जा सकता है अगर एन-टर्मिनस ग्ली-ली-एलयू अवशेष (जीएल) है और जिसमें से अन्य सी-टर्मिनस एनजीएल अवशेष10है । हालांकि, केवल प्रोटीन मोनोमर को जोड़ने के लिए OaAEP1 का उपयोग साइस्टीन आधारित युग्मन विधि जैसे अनियंत्रित अनुक्रम के साथ प्रोटीन बहुलक की ओर जाता है। इसलिए, हम प्रोटीन इकाई के एन-टर्मिनस को हटाने योग्य टीईवी प्रोटीज़ साइट के साथ-साथ ENLYFQ/G-L-POI के रूप में एक ल्यूसिन अवशेषों के साथ डिजाइन करते हैं । टीईवी क्लीवेज से पहले, एन-टर्मिनल OaAEP1 लिगेशन में भाग नहीं लेगा। और फिर एन-टर्मिनस में जीएल अवशेष, जो आगे OaAEP1 लिगेशन के साथ संगत हैं, TEV दरार के बाद उजागर होता है। इस प्रकार, हमने अपेक्षाकृत अच्छी तरह से नियंत्रित अनुक्रम के साथ पॉलीप्रोटीन की एक अनुक्रमिक एंजाइमैटिक बायोसिंथेसिस विधि हासिल की है।
यहां, हमारे स्टेपवाइज एंजाइमैटिक संश्लेषण विधि का उपयोग पॉलीप्रोटीन नमूना तैयारकरने में किया जा सकता है, जिसमें अनुक्रम-नियंत्रित और अनियंत्रित, और एकल अणु अध्ययनों के लिए प्रोटीन स्थिरीकरण भी शामिल है, विशेष रूप से जटिल प्रणाली के लिए जैसे मेटलोप्रोटीन।
इसके अलावा, एएफएम आधारित एसएमएफएस प्रयोग हमें एकल अणु स्तर पर प्रोटीन बहुलक निर्माण और स्थिरता की पुष्टि करने की अनुमति देते हैं । एएफएम, ऑप्टिकल ट्वीजर और मैग्नेटिक ट्वीजर सहित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी, नैनो में एक सामान्य उपकरण है जो यांत्रिक रूप से जैव अणु में हेरफेर करता है और उनकी स्थिरता को मापताहै 11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20। एकल अणु एएफएम का व्यापक रूप से प्रोटीन (यूएन) फोल्डिंग21,22,23,24,25,रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन26,27,28,29,30,31,32,33,34के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गयाहै, 35, अकार्बनिक रासायनिक बॉन्ड20,36,37,38,39,40,41,42,43 औरमेटललोप्रोटीन44,45,46,47,48,49,50 में धातु-लिगलैंड बॉन्ड . यहां, एकल अणु AFM इसी प्रोटीन खुलासा संकेत के आधार पर संश्लेषित पॉलीप्रोटीन अनुक्रम को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एंजाइमैटिक बायोसिंथेसिस और पॉलीप्रोटीन के स्थिरीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है और एएफएम-आधारित एसएमएफएस द्वारा पॉलीप्रोटीन डिजाइन का सत्यापन किया है। यह पद्धति एक डिजाइन किए गए अनुक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 21771103, 21977047), जियांग्सू प्रांत के नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर एक) ने सपोर्ट किया। बीके20160639) और जियांग्सू प्रांत का शुआंगचुआंग कार्यक्रम।
Materials
| iron (III) chloride hexahydrate | Energy chemical | 99% | |
| Zinc chloride | Alfa Aesar | 100.00% | |
| calcium chloride hydrate | Alfa Aesar | 99.9965% crystalline aggregate | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Life Science | Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | ≥99% | |
| sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate | Thermo Scientific | 90% | |
| Glycerol | Macklin | 99% | |
| 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) | Alfa Aesar | ||
| Genes | Genscript | ||
| Equipment | |||
| Nanowizard 4 AFM | JPK Germany | ||
| MLCT cantilever | Bruker Corp | ||
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | ||
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | ||
| Glass coverslip | Sail Brand | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Avanti JXN-30 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Gel Image System | Tanon |
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