Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per coniugare il monomero proteico mediante enzimi formando polimeri proteici con una sequenza controllata e immobilizzandolo sulla superficie per studi di spettroscopia di forza singola molecola.

Abstract

Le tecniche chimiche e di bioconiugazione sono state sviluppate rapidamente negli ultimi anni e consentono la costruzione di polimeri proteici. Tuttavia, un processo di polimerizzazione delle proteine controllato è sempre una sfida. Qui, abbiamo sviluppato una metodologia ezimatica per la costruzione di proteine polimerizzate passo dopo passo in una sequenza controllata razionalmente. In questo metodo, il capolinea C di un monomero proteico è NGL per la coniugazione proteica che utilizza OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mentre l’N-terminus era un TEV scissione scissione scissione scissione scissionio più un L (ENLYFQ/GL) per la protezione temporanea dei N-terminali. Di conseguenza, OaAEP1 è stato in grado di aggiungere un solo monomero proteico alla volta, e poi la proteasi TEV ha sfoltito il N-terminus tra Q e G per esporre l’NH₂-Gly-Leu. Quindi l’unità è pronta per la prossima legatura OaAEP1. La poliproteina ingegnerizzata viene esaminata dispiegando un singolo dominio proteico utilizzando la spettroscopia a forza singola a forza atomica a base di microscopia (AFM-SMFS). Pertanto, questo studio fornisce una strategia utile per l’ingegneria poliproteica e l’immobilizzazione.

Introduction

Rispetto ai polimeri sintetici, le proteine naturali multidominio hanno una struttura uniforme con un numero ben controllato e un tipo di sottodomini¹. Questa caratteristica di solito porta a migliorare la funzione biologica e la stabilità^2,3. Molti approcci, come l’accoppiamento del legame disulfide a base di cisteina e la tecnologia del DNA ricombinante, sono stati sviluppati per la costruzione di una proteina polimerizzata con più domini^4,5,6^,7. Tuttavia, il primo metodo si traduce sempre in una sequenza casuale e incontrollata, e il secondo porta ad altri problemi, tra cui la difficoltà per la sovraespressione di proteine tossiche e di grandi dimensioni e la purificazione di proteine complesse con cofattore e altri enzimi delicati.

Per affrontare questa sfida, sviluppiamo un metodo ezimatico che coniuga il monomero proteico insieme per polimero/poliproteina in modo graduale utilizzando una proteina ligase OaAEP1 combinata con un TEV di proteasi^8,9. OaAEP1 è un endopeptidase rigoroso ed efficiente. Due proteine possono essere collegate covalentmente come sequenza Asn-Gly-Leu (NGL) attraverso due termini da OaAEP1 in meno di 30 min se lo N-terminus è residui di Gly-Leu (GL) e l’altro di cui il C-terminus è residui NGL¹⁰. Tuttavia, l’uso di OaAEP1 solo per collegare il monomero proteico porta a un polimero proteico con una sequenza incontrollata come il metodo di accoppiamento a base di cisteina. Pertanto, progettiamo il capo N dell’unità proteica con un sito di proteasi TEV rimovibile più un residuo di leucina come ENLYFQ/G-L-POI. Prima della scissione TEV, il terminale N non avrebbe partecipato alla legatura OaAEP1. E poi i residui di GL a N-terminus, che sono compatibili con l’ulteriore legatura OaAEP1, viene esposto dopo la scissione TEV. Così, abbiamo raggiunto un metodo di biosintesi ezimatica sequenziale della poliproteina con una sequenza relativamente ben controllata.

Qui, il nostro metodo di sintesi ezimatica graduale può essere utilizzato nella preparazione del campione di poliproteina, compresa la produzione di campioni di poliproteina, inclusa la sequenza controllata e incontrollata, e l’immobilizzazione delle proteine anche per studi a singola molecola, in particolare per il sistema complesso come metalloproteina.

Inoltre, gli esperimenti SMFS basati su AFM ci permettono di confermare la costruzione e la stabilità del polimero proteico a livello di singola molecola. La spettroscopia di forza a singola molecola, tra cui AFM, pinzetta ottica e pinzetta magnetica, è uno strumento generale nella nanotecnologia per manipolare la biomolecola meccanicamente e misurare la loro stabilità^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. AFM a singola molecola è stato ampiamente utilizzato nello studio delle proteine (un)folding^{21,22,23,24,25}, la misura della forza di interazione recettore-ligando^{26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35}, legame chimico inorganico^{20,36,37,38,39,40,41,42,43} e legame metallo-ligando in metalloproteine^{44,45,46,47,48,49,50} . In questo caso, l’AFM a singola molecola viene utilizzato per verificare la sequenza di poliproteine sintetizzate in base al corrispondente segnale di spiegatura delle proteine.

Protocol

1. Produzione di proteine Clone genico Acquistare geni codificando per la proteina di interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, il modulo di cellulosa-legante (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) e coesione da Ruminococcus flavefacience, tabacco etch virus (TEV) protease, polietidi elastin-like (ELP). Eseguire la reazione a catena della polimerasi e utilizzare il sistema enzimatico di digestione a tre restrizioni BamHI-Bgl</e…

Representative Results

I residui NGL introdotti tra le proteine adiacenti dalla legatura OaAEP1 non influiscono sulla stabilità del momomero proteico nel polimero poiché la forza di dispiegamento (<Fu>) e l’incremento della lunghezza del contorno (<z-zlc>) sono paragonabili allo studio precedente (Figura 1). Il risultato della purificazione della proteina rubredossina è mostrato nella Figura 2. Per dimostrare la proteina dopo che la scissione TEV è compatibil…

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per la biosintesi e l’immobilizzazione eimmobilistica della poliproteina e verificato la progettazione della poliproteina da parte di SMFS basato su AFM. Questa metodologia fornisce un nuovo approccio alla costruzione del polimero proteico in una sequenza progettata, che integra i metodi precedenti per l’ingegneria poliproteina e l’immobilizzazione^{4,6,52,53,…}

Materials

iron (III) chloride hexahydrate	Energy chemical		99%
Zinc chloride	Alfa Aesar		100.00%
calcium chloride hydrate	Alfa Aesar		99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid	Sigma Life Science		Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich		≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate	Thermo Scientific		90%
Glycerol	Macklin		99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)	Alfa Aesar
Genes	Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM	JPK Germany
MLCT cantilever	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC system	GE Healthcare
Glass coverslip	Sail Brand
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge	Beckman Coulter
Gel Image System	Tanon