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Biochimie

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。

Abstract

化学・バイオコンジュゲーション技術は近年急速に開発され、タンパク質ポリマーの構築が可能です。しかし、制御されたタンパク質重合プロセスは常に課題です。ここでは、合理的に対照的な配列で重合タンパク質を段階的に構築するための酵素的方法論を開発しました。この方法では、タンパク質モノマーのC末端は、OaAEP1(オルデンランディア・アフィニアスパラジニアル・エンドペプチダーゼ)1)を用いたタンパク質結合のためのNGLであり、N末端は一時的なN末端保護のための鎖切りTEV(タバコエッチウイルス)切断部位に加えてL(ENLYFQ/GL)であった。その結果、OaAEP1は一度に1つのタンパク質モノマーのみを添加することができ、その後TEVプロテアーゼはQとGの間のN末経を切断してNH 2-Gly-Leuを暴露した。その後、ユニットは次のOaAEP1ライゲーションの準備ができています。この工学的ポリタンパク質は、原子間力顕微鏡ベースの単分子力分光法(AFM-SMFS)を用いて個々のタンパク質ドメインを展開することによって検査される。したがって、本研究は、ポリタンパク質工学と固定化のための有用な戦略を提供する。

Introduction

合成ポリマーと比較して、天然の多ドメインタンパク質は、サブドメイン1の数と種類がよく制御された均一な構造を有する。この機能は、通常、改善された生物学的機能と安定性2、3をもたらす。システイン系ジスルフィド結合結合結合や組換えDNA技術など多くのアプローチが、複数ドメイン4、5、6、7を有する重合タンパク質を構築するために開発されている。しかし、前者の方法は常にランダムで制御されていない配列を生み出し、後者の方法は、有毒で大きなタンパク質の過剰発現の困難さや、補因子やその他の繊細な酵素による複雑なタンパク質の精製など、他の問題につながります。

この課題に対応するため、プロテアーゼTEV8,9と組み合わせたプロテインリガーゼOaAEP1を用いて、ポリマー/ポリタンパク質のタンパク質モノマーを段階的に結合する酵素法を開発しています。OaAEP1 は、厳格かつ効率的な内ペプチダーゼ.2つのタンパク質は、N末限がGly-Leu残基(GL)であり、C末終点がNGL残基である他のタンパク質がNGL残基である場合、30分以内にOaAEP1によって2つのテルミニを介してAsn-Gly-Leu配列(NGL)として共有結合することができる。しかし、OaAEP1を使用してタンパク質モノマーをリンクさせると、システイン系カップリング法のような制御されていない配列を有するタンパク質ポリマーに導く。そこで、取り外し可能なTEVプロテアーゼ部位とロイシン残基をENLYFQ/G-L-POIとして持つタンパク質ユニットのN末限を設計しています。TEV切断の前に、N末端はOaAEP1ライゲーションに関与しなかった。そして、さらにOaAEP1ライゲーションと互換性があるN末経でGL残基がTEV切断後に暴露される。このように、比較的良好な配列を持つポリタンパク質の逐次酵素生合成法を達成した。

ここでは、当社の段階的酵素合成法は、配列制御および制御されていないポリタンパク質サンプル調製法、および単分子研究のためのタンパク質固定化、特に次のような複雑系に使用することができます。金属タンパク質。

さらに、AFMベースのSMFS実験により、タンパク質ポリマーの構造と安定性を単一分子レベルで確認することができます。AFM、光ツイーザー、磁気ツイーザーを含む単分子力分光法は、ナノテクノロジーにおける一般的なツールで、生体分子を機械的に操作し、その安定性を測定する11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である。単分子AFMは、タンパク質(un)折りたたみ21、22、23、24、25、受容体リガンド相互作用26、27、28、29、30、31、32、33、34の研究で広く使用されています。 35,無機化学結合20,36,37,38,39,40,41,42,43および金属- リガンド結合 , 金属タンパク質44,45,46,47,48,49,50.ここで、単分子AFMは、対応するタンパク質展開シグナルに基づいて合成されたポリタンパク配列を検証するために使用される。

Protocol

1. タンパク質の生産 遺伝子クローン 目的タンパク質(POI)用にコード化した遺伝子(POI):ユビキチン、ルブレドキシン(RD)51、セルロース結合モジュール(CBM)、ドッカリンXドメイン(XDoc)およびルミノコッカスフラベファシス、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、エラスチン様ポリペプチド(Elps)からの凝集体。 ポリメラーゼ連鎖反?…

Representative Results

OaAEP1ライゲーションによって隣接するタンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力()としてポリマー中のタンパク質モノマー安定性に影響を及ぼさないし、輪郭長増分(<ΔLc>)は前の研究と同等である(図1)。このルブレドキシンタンパク質の精製結果を図2に示す。TEV切断後のタンパク質が、制御配列を有するタンパク質ポリマー?…

Discussion

我々は、ポリタンパク質の酵素性生合成および固定化のためのプロトコルを説明し、AFMベースのSMFSによるポリタンパク質設計を検証した。この方法論は、ポリタンパク質工学と固定化4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61のための以前の方法を補完する、設計された配列でタンパク質ポリマーを構築する?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国自然科学財団(グラントNo.21771103、21977047)、江蘇省自然科学財団(グラントNo.)BK20160639)と江蘇省双荘プログラム。

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
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OaAEP1Enzymatic SynthesisPolymerized ProteinSingle-molecule Force SpectroscopyProtein OligomerPolymerization DegreeProtein-based MaterialCysteinePotassium ChromateSulfuric AcidAPTESSulfo-SMCCGL-ELP-50 Cys-proteinCantilever Surface
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
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