Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana
Summary
Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l’uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.
Abstract
I preparati per fetta cardiaca umana sono stati recentemente sviluppati come piattaforma per gli studi di fisiologia umana e i test terapeutici per colmare il divario tra gli studi sugli animali e quelli clinici. Numerosi modelli animali e cellulari sono stati utilizzati per esaminare gli effetti dei farmaci, ma queste risposte spesso differiscono negli esseri umani. Le fette cardiache umane offrono un vantaggio per i test antidroga in quanto sono direttamente derivate da cuori umani vitali. Oltre ad aver conservato strutture multicellulari, accoppiamento cellulare e ambienti a matrice extracellulare, le fette di tessuto cardiaco umano possono essere utilizzate per testare direttamente l’effetto di innumerevoli farmaci sulla fisiologia cardiaca umana adulta. Ciò che distingue questo modello da altre preparazioni cardiache, come cuori interi o cunei, è che le fette possono essere sottoposte a una cultura a lungo termine. Come tale, fette cardiache consentono di studiare gli effetti acuti e cronici dei farmaci. Inoltre, la capacità di raccogliere diverse centinaia o mille fette da un solo cuore rende questo un modello ad alto throughput per testare diversi farmaci a concentrazioni diverse e combinazioni con altri farmaci allo stesso tempo. Le fette possono essere preparate da qualsiasi regione del cuore. In questo protocollo, descriviamo la preparazione di fette ventricolari a sinistra isolando i cubi di tessuto dalla parete libera ventricolare sinistra e sezionandoli a fette utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione. Queste fette possono quindi essere sottoposte a esperimenti acuti per misurare la funzione elettrofisiologica cardiaca di base o coltivate per studi sui farmaci cronici. Questo protocollo descrive anche la doppia mappatura ottica delle fette cardiache per registrazioni simultanee di potenziali transmembrani e dinamiche intracellulari del calcio per determinare gli effetti dei farmaci studiati.
Introduction
I modelli animali sono stati un valido strumento utilizzato per comprendere i meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia umana, nonché una piattaforma per la sperimentazione preliminare delle terapie per il trattamento di varie malattie1. Sono stati compiuti grandi passi avanti nel campo della ricerca biomedica basata su questi studi sugli animali2. Tuttavia, esistono differenze significative tra le specie tra le fisiologie umane e animali, tra cui topi, ratti, porcellini d’India, conigli, pecore, maiali e cani3,4. Di conseguenza, ci sono state numerose terapie farmacologiche, geniche e cellulari che hanno mostrato promessa durante la fase di sperimentazione animale, ma non sono riuscite a vivere fino ai risultati negli studi clinici5. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati come modelli per colmare la risposta della fisiologia umana a vari farmaci e malattie a vari farmaci e malattieindottedall’uomo. I cardiomiociti derivati dalle cellule staminali sono stati ampiamente utilizzati nei sistemi organo-su-chip come surrogato del cuore6,7,8. Tuttavia, l’utilità dei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) è ostacolata dal loro fenotipo relativamente immaturo e dalla mancanza di rappresentazione della sottopopolazione cardiomiocita; il miocardio maturo è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule coesistenti come fibroblasti, neuroni, macrofagi e cellule endoteliche. D’altra parte, i cardiomiociti umani isolati sono elettricamente maturi, e diverse sottopopolazioni cardiomiociti possono essere ottenute alterando i parametri di coltura9. Tuttavia, questi miociti mostrano generalmente un’azione alterata potenziali morfologie a causa della mancanza di accoppiamento cellulare, rapida de-differenziazione, e la comparsa di comportamento proaritmico in vitro10,11. Alcune delle limitazioni sono state affrontate da modelli di coltura cellulare 3D di iPSC-CMs e miociti cardiaci. Questi modelli, che includono sferoidi, scaffold idrogel incapsulati colture 3D, tessuti cardiaci ingegnerizzati (EIT) e sistemi cuore su un chip, utilizzano più popolazioni di cellule cardiache come cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali. Si auto-assemblano o assemblano lungo un ponteggio per formare strutture 3D, e alcuni riproducono anche la complessa natura anisotropica del miocardio. Questi modelli sono stati segnalati per avere cellule di fenotipi maturi, proprietà contrattuali, e profili molecolari simili al tessuto cardiaco. Il sistema heart-on-a-chip consente anche lo studio degli effetti sistemici nei modelli di droga e malattia. Tuttavia, i modelli a base di cellule in vitro non hanno la matrice extracellulare nativa e quindi non sono in grado di imitare con precisione l’elettrofisiologia a livello di organo. Le fette cardiache umane, al contrario, hanno una matrice extracellulare intatta e contatti autocellulari a cellule, il che li rende utili per esaminare con maggiore precisione le proprietà aritmogene del miocardio umano.
I ricercatori hanno sviluppato fette di organotipiche cardiache umane come piattaforma preclinica fisiologica per test sui farmaci acuti e cronici e per studiare l’elettrofisiologia cardiaca e la progressione delle malattie cardiache12,13,14,15,16,17,18,19. Rispetto ai cardiomiociti derivati da iPSC, le fette cardiache umane replicano più fedelmente l’elettrofisiologia cardiaca umana adulta con un fenotipo cardiomiocito maturo. Rispetto ai cardiomiociti umani isolati, le fette cardiache presentano durate potenziali di azione fisiologica a causa dell’accoppiamento cellula-cellula ben conservato e dell’esistenza intrinseca dei loro ambienti nativi intra ed extracellulari.
Questo protocollo descrive il processo di generazione di fette cardiache umane da cuori interi donatori, eseguendo studi acuti (cioè di ore) e cronici (cioè giorni lunghi) per testare i parametri di elettrofisiologia cardiaca tramite mappatura ottica. Mentre questo protocollo descrive solo l’uso del tessuto ventricolare sinistro (LV), è stato applicato con successo ad altre regioni del cuore così come altre specie come topi, ratti, porcellini d’India e maiali14,20,2121,22. Il nostro laboratorio utilizza interi cuori donatrici che sono stati respinti per il trapianto negli ultimi 5 anni, ma è possibile che queste stesse procedure vengano eseguite su qualsiasi tessuti campione di cuore donatore ottenuti con mezzi alternativi (ad esempio, impianti di assistenza ventricolare sinistra [LVAD], biopsie, miectomie) purché i tessuti abbiano la capacità di essere sezionati in cubi. La mappatura ottica viene utilizzata per l’analisi in questo studio a causa della sua capacità di mappare simultaneamente potenziali di azione ottica e transitori di calcio con alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel) e temporale (>1,000 fotogrammi/s). È anche possibile utilizzare metodi alternativi, come gli array multielettrodi (MEA) o i microelettrodi, ma queste tecniche sono limitate dalle loro risoluzioni spaziali relativamente basse. Inoltre, i MEA sono stati progettati per l’uso con le colture cellulari e i microelettrodi taglienti sono più facilmente gestiti per l’uso con cuori interi o grandi cunei di tessuto.
L’obiettivo dell’articolo è quello di consentire a più ricercatori di utilizzare tessuti cardiaci umani per studi di elettrofisiologia cardiaca. Va notato che la tecnologia descritta in questo articolo è relativamente semplice e vantaggiosa per gli studi a breve termine (nell’ordine di diverse ore a giorni). Più fisiologica cultura biomimetica per studi a lungo termine (nell’ordine di settimane) è stato discusso e descritto da una serie di altri studi12,18,23. Stimolazione elettrica, carico meccanico e stretching dei tessuti sono meccanismi di condizionamento vantaggiosi che possono aiutare a limitare l’insorgenza del rimodellamento del tessuto in vitro12,18,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo metodi passo-passo per ottenere fette cardiache vitali da cuori umani arrestati cardioplegically e per caratterizzare funzionalmente le fette utilizzando la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana e del calcio intracellulare. Con l’ambiente extracellulare preservato e l’accoppiamento nativo delle cellule cellulari, le fette cardiache umane possono essere utilizzate come modello accurato del cuore umano per la scoperta scientifica fondamentale e per i test di efficacia e cardiotossicità di a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti di NIH (sovvenzioni R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), della fondazione Leducq (progetto RHYTHM) e di una borsa di studio post-dottorato dell’American Heart Association (19POST34370122) sono riconosciuti.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
