Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie
Summary
We presenteren een protocol voor het immobiliseren van enkele macromoleculen in microfluïde apparaten en het kwantificeren van veranderingen in hun conformaties onder schuifstroom. Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische en functionele eigenschappen van biomoleculen zoals eiwitten en DNA in een stroomomgeving.
Abstract
Single-molecule gedrag onder mechanische verstoring is op grote schaal gekenmerkt om veel biologische processen te begrijpen. Methoden zoals atoomkrachtmicroscopie hebben echter een beperkte tijdelijke resolutie, terwijl Förster resonance energy transfer (FRET) alleen voegformaties kan voorkomen. Fluorescentie microscopie, aan de andere kant, maakt real-time in situ visualisatie van enkele moleculen in verschillende stroomomstandigheden. Ons protocol beschrijft de stappen om conformatieveranderingen van afzonderlijke biomoleculen onder verschillende schuifstromenomgevingen vast te leggen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De schuifstroom wordt gemaakt in microfluïde kanalen en wordt aangestuurd door een spuitpomp. Als demonstraties van de methode, von Willebrand factor (VWF) en lambda DNA worden gelabeld met biotine en fluorophore en vervolgens geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Hun conformaties worden continu gecontroleerd onder variabele schuifstroom met behulp van totale interne reflectie (TIRF) en confocale fluorescentie microscopie. De omkeerbare ontrafelende dynamiek van VWF zijn nuttig om te begrijpen hoe de functie ervan is geregeld in menselijk bloed, terwijl de conformatie van lambda DNA inzichten biedt in de biofysica van macromoleculen. Het protocol kan ook op grote schaal worden toegepast om het gedrag van polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en om de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken.
Introduction
Mechanismen voor hoe biomoleculen reageren op omgevingsstimuli zijn op grote schaal bestudeerd. Vooral in een stromingsomgeving reguleren schuif- en verlengingskrachten de conformatieveranderingen en mogelijk de functie van biomoleculen. Typische voorbeelden zijn shear-geïnduceerde ontrafeling van lambda DNA en von Willebrand factor (VWF). Lambda DNA is gebruikt als een instrument om de conformatiedynamiek van individuele, flexibele polymeerketens en de reheologie van polymeeroplossingen1,2,3,4te begrijpen. VWF is een natuurlijke stroomsensor die bloedplaatjes op wondlocaties van bloedvaten samenvoegt met abnormale afschuifsnelheden en stromingspatronen. Het ontrafelen van VWF is essentieel bij het activeren van de binding van bloedplaatjes aan het A1-domein en collageenbinding aan het A3-domein. Bovendien maakt het uitvouwen van een hoge afschuifbare A2-domein het decolleté van VWF mogelijk, dat de moleculaire gewichtsverdeling in omloop5,6regelt. Zo kan directe visualisatie van hoe deze moleculen zich gedragen onder stroom ons fundamentele begrip van hun biomechanica en functie aanzienlijk verbeteren, wat op zijn beurt nieuwe diagnostische en therapeutische toepassingen mogelijk kan maken.
Typische methoden om single-molecule conformaties te karakteriseren zijn optische / magnetische pincet, atomaire kracht microscopie (AFM) en single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (FRET)7. Single-molecule kracht spectroscopie is een krachtig instrument om de kracht en beweging geassocieerd met de conformatieveranderingen van biomoleculen te onderzoeken. Het ontbreekt echter aan de mogelijkheid om de algehele moleculaire conformaties in kaart te brengen8. AFM is in staat om te beeldvorming met een hoge ruimtelijke resolutie, maar is beperkt in temporele resolutie9,10. Bovendien kan contact tussen de tip en het monster de respons die door de stroom wordt veroorzaakt, verwarren. Andere methoden zoals FRET en nanoporie analytics bepalen single-molecule eiwit vouwen en ontvouwen staten op basis van de detectie van intramoleculaire afstand en uitgesloten volumes. Deze methoden staan echter nog in de kinderschoenen en beperkt in hun directe observatie van enkelmolecuulconformaties11,12,13,14.
Aan de andere kant heeft het direct observeren van macromoleculen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie onder fluorescentiemicroscopie ons begrip van de dynamiek van één molecuul in veel biologische processenverbeterd 15,16. Zo hebben Fu et al. onlangs voor het eerst gelijktijdige visualisatie van VWF-verlenging en bloedplaatjesreceptorbinding bereikt. In hun werk werden VWF-moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak van een microfluïdisch kanaal door middel van biotine-streptavidin interacties en afgebeeld onder totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie in verschillende schuifstroom omgevingen17. Door een soortgelijke methode toe te passen als Fu’s, tonen we hier aan dat conformaties van VWF en lambda DNA direct kunnen worden waargenomen onder zowel TIRF als confocale fluorescentiemicroscopie. Zoals in figuur 1wordt weergegeven, worden microfluïde apparaten gebruikt om de schuifstroom te maken en te controleren en worden biomoleculen geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Bij toepassing van verschillende afschuifsnelheden worden conformaties van hetzelfde molecuul geregistreerd om de lengte te meten, ook weergegeven in figuur 1. De methode kan op grote schaal worden toegepast om ander polymeergedrag te onderzoeken onder complexe stromingsomgevingen voor zowel rheologische als biologische studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen van conformatieveranderingen met één molecuul met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals beschreven in deze methode, is het van cruciaal belang om het molecuul voor de juiste hoeveelheid tijd uit te broeden, de niet-specifieke interacties met het oppervlak te minimaliseren en stel microscoopinstellingen vast die het bleken van foto’s verminderen. Het vermogen van het molecuul om vrij te veranderen bevleesdheid is gerelateerd aan het aantal biotine-streptavidin interacties…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Science Foundation subsidie DMS-1463234, National Institutes of Health subsidies HL082808 en AI133634, en Lehigh University interne financiering.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
