फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ कतरनी प्रवाह के तहत एकल अणु संरचना परिवर्तन की विशेषता
Summary
हम माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों में एकल मैक्रोअणुओं को स्थिर करने और कतरनी प्रवाह के तहत उनकी संरचनाओं में परिवर्तन ों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल प्रवाह वातावरण में प्रोटीन और डीएनए जैसे जैव अणुओं के जैव यांत्रिक और कार्यात्मक गुणों की विशेषता के लिए उपयोगी है।
Abstract
यांत्रिक क्षोभ के तहत एकल अणु व्यवहार को कई जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए व्यापक रूप से विशेषता दी गई है। हालांकि, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जैसे तरीकों में सीमित लौकिक संकल्प होता है, जबकि फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) केवल संरचनाओं को अनुमानित करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, विभिन्न प्रवाह स्थितियों में एकल अणुओं के सीटू दृश्य में वास्तविक समय की अनुमति देता है। हमारा प्रोटोकॉल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विभिन्न कतरनी प्रवाह वातावरण के तहत एकल जैव अणुओं के संरचना परिवर्तनों को पकड़ने के चरणों का वर्णन करता है। कतरनी प्रवाह माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के अंदर बनाया जाता है और एक सिरिंज पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। विधि के प्रदर्शनों के रूप में, वॉन विल्लेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) और लैम्ब्डा डीएनए को बायोटिन और फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है और फिर चैनल की सतह पर स्थिर किया जाता है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब (टीआईआरएफ) और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चर कतरनी प्रवाह के तहत उनकी संरचनाओं की लगातार निगरानी की जाती है। VWF की रिवर्सिबल unraveling गतिशीलता यह समझने के लिए उपयोगी हैं कि मानव रक्त में इसके कार्य को कैसे विनियमित किया जाता है, जबकि लैम्ब्डा डीएनए की संरचना मैक्रोमॉलिक्यूल्स के बायोफिजिक्स में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रवाह स्थितियों में बहुलक, विशेष रूप से बायोपॉलिमर के व्यवहार का अध्ययन करने और जटिल तरल पदार्थों के रीलॉजी की जांच करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Introduction
जैव अणु पर्यावरण ीय स्टिमुली का जवाब कैसे देते हैं, इसका तंत्र व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से एक प्रवाह वातावरण में, कतरनी और लम्बी ताकतें संरचना परिवर्तनों और संभावित रूप से जैव अणुओं के कार्य को विनियमित करती हैं। विशिष्ट उदाहरणों में लैम्ब्डा डीएनए और वॉन विल्लेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) की कतरनी-प्रेरित unraveling शामिल हैं। लैम्ब्डा डीएनए का उपयोग व्यक्तिगत, लचीली बहुलक श्रृंखलाओं और बहुलकसमाधान1,2,3,4की रीलॉजी की संरचना गतिशीलता को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया है। VWF एक प्राकृतिक प्रवाह सेंसर है जो असामान्य कतरनी दरों और प्रवाह पैटर्न के साथ रक्त वाहिकाओं के घाव साइटों पर प्लेटलेट्स को एकत्र करता है। ए3 डोमेन के लिए बाध्यकारी A1 डोमेन और कोलेजन के लिए प्लेटलेट्स के बंधन को सक्रिय करने में VWF का सुलझाना आवश्यक है। इसके अलावा, उच्च कतरनी-प्रेरित A2 डोमेन खुलासा VWF के दरार की अनुमति देता है, जो संचलन5,6में अपने आणविक वजन वितरण को नियंत्रित करता है । इस प्रकार, इन अणुओं के प्रवाह के तहत व्यवहार करने का प्रत्यक्ष दृश्य उनके बायोमैकेनिक्स और कार्य के बारे में हमारी मौलिक समझ को बहुत बढ़ा सकता है, जो बदले में उपन्यास नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों को सक्षम कर सकता है।
एकल अणु संरचनाओं की विशेषता के लिए विशिष्ट पद्धतियों में ऑप्टिकल/चुंबकीय चिमटी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और एकल-अणु फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET)7शामिल हैं । एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी जैव अणुओं के संरचना परिवर्तनों से जुड़े बल और गति की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, यह समग्र आणविक संरचनाओं8नक्शा करने की क्षमता का अभाव है । एएफएम उच्च स्थानिक संकल्प के साथ इमेजिंग करने में सक्षम है लेकिन लौकिक संकल्प9,10में सीमित है । इसके अलावा, टिप और नमूने के बीच संपर्क प्रवाह से प्रेरित प्रतिक्रिया को चकित कर सकता है। FRET और नैनोपोर एनालिटिक्स जैसे अन्य तरीके इंट्रामॉलिक्यूलर दूरी और बहिष्कृत मात्रा का पता लगाने के आधार पर एकल अणु प्रोटीन तह और खुलासा राज्यों का निर्धारण करते हैं । हालांकि, ये विधियां अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में हैं और एकल अणु संरचनाओं11,12,13,14के प्रत्यक्ष अवलोकन में सीमित हैं।
दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ मैक्रो अणुओं को सीधे देखने से कई जैविक प्रक्रियाओं15,16में एकल अणु गतिशीलता के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है । उदाहरण के लिए, Fu et al. हाल ही में पहली बार के लिए VWF विस्तार और प्लेटलेट रिसेप्टर बाध्यकारी के एक साथ दृश्य हासिल की । अपने काम में, VWF अणुओं को बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन के माध्यम से एक माइक्रोफ्लूइडिक चैनल की सतह पर स्थिर किया गया था और कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी के तहत अलग-अलग कतरनी प्रवाह वातावरण17पर चित्रित किया गया था। फू के रूप में एक ऐसी ही विधि लागू करने, हम यहां प्रदर्शित करते है कि VWF और lambda डीएनए की संरचनाओं सीधे दोनों TIRF और confocal फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया जा सकता है । जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों का उपयोग कतरनी प्रवाह को बनाने और नियंत्रित करने के लिए किया जाता है, और चैनल की सतह पर जैव अणुओं को स्थिर किया जाता है। अलग-अलग कतरनी दरों के आवेदन पर, एक्सटेंशन लम्हों को मापने के लिए एक ही अणु की संरचनाएं दर्ज की जाती हैं, जो चित्र 1में भी दिखाई जाती हैं। विधि व्यापक रूप से दोनों rheological और जैविक अध्ययन के लिए जटिल प्रवाह वातावरण के तहत अन्य बहुलक व्यवहार का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि में वर्णित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-अणु संरचना परिवर्तनों के उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, उचित समय के लिए अणु को इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है, सतह के साथ इसकी…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान DMS-1463234, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान HL082808 और AI133634, और Lehigh विश्वविद्यालय आंतरिक वित्तपोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
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