Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией
Summary
Мы представляем протокол для иммобилизации отдельных макромолекулв в микрофлюидных устройствах и количественной изменения в их конформации при потоке сдвига. Этот протокол полезен для характеристики биомеханических и функциональных свойств биомолекул, таких как белки и ДНК в среде потока.
Abstract
Одномолекулярное поведение при механических возмущениях характеризуется широко, чтобы понять многие биологические процессы. Однако такие методы, как атомная силовая микроскопия, имеют ограниченное временное разрешение, в то время как режит энергии Фюрстера (FRET) только позволяет делать вывод о конформах. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, позволяет в режиме реального времени на месте визуализации отдельных молекул в различных условиях потока. Наш протокол описывает шаги по захвату конформансальных изменений отдельных биомолекул в различных средах потока сдвига с помощью флуоресценционной микроскопии. Поток сдвига создается внутри микрофлюидных каналов и контролируется шприц насосом. В качестве демонстрации метода, фон Willebrand фактор (VWF) и лямбда ДНК помечены биотин омичи и фторфора, а затем обездвижены на поверхности канала. Их конформации постоянно контролируются при переменном потоке сдвига с использованием общего внутреннего отражения (TIRF) и конфокальной флуоресценции микроскопии. Реверсивная динамика распутывания VWF полезна для понимания того, как регулируется его функция в крови человека, в то время как конформация ДНК лямбды дает представление о биофизике макромолекул. Протокол также может быть широко применен для изучения поведения полимеров, особенно биополимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей.
Introduction
Механизмы реагирования биомолекул на экологические стимулы были изучены широко. В среде потока, в частности, сдвига и удлиненные силы регулируют конформационные изменения и, возможно, функции биомолекул. Типичные примеры включают сдвига индуцированной распутывание лямбда ДНК и фон Willebrand фактор (VWF). Ламбда ДНК была использована в качестве инструмента для понимания конформационной динамики отдельных, гибких полимерных цепей и реологии полимерных решений1,2,3,4. VWF является естественным датчиком потока, который агрегирует тромбоциты на участках раны кровеносных сосудов с ненормальными скоростью сдвига и структурой потока. Разгадка VWF имеет важное значение для активации связывания тромбоцитов с доменом A1 и связывания коллагена с доменом A3. Кроме того, высокий сдвига индуцированных A2 домена разворачивается позволяет расщепление VWF, который регулирует его молекулярное распределение веса вобращении5,6. Таким образом, прямая визуализация того, как эти молекулы ведут себя под потоком, может значительно улучшить наше фундаментальное понимание их биомеханики и функции, что, в свою очередь, может позволить новые диагностические и терапевтические применения.
Типичные методологии для характеристики одномолекулярных конформации включают оптические/магнитные пинцеты, атомную микроскопию силы (AFM) и одномолекулярную рецензируемую рецензию Фюрстера (FRET)7. Одномолекулярная силовая спектроскопия является мощным инструментом для исследования силы и движения, связанных с конформационными изменениями биомолекул. Тем не менее, ему не хватает возможности составить карту общих молекулярных конформий8. AFM способен к визуализации с высоким пространственным разрешением, но ограничен в временном разрешении9,10. Кроме того, контакт между кончиком и образцом может затруднить реакцию, вызванную потоком. Другие методы, такие как FRET и нанопорная аналитика, определяют одномолекулярные белковые складные и разворачивающиеся состояния на основе обнаружения внутримолекулярного расстояния и исключенных объемов. Тем не менее, эти методы все еще находятся в зачаточном состоянии и ограничены в их прямом наблюдении одномолекулярных конформации11,12,13,14.
С другой стороны, непосредственное наблюдение макромолекулы с высоким висальным и пространственным разрешением при флуоресценционной микроскопии улучшило наше понимание одномолекулярной динамики во многих биологических процессах15,16. Например, Fu et al. недавно впервые добились одновременной визуализации удлинения VWF и связывания рецепторов тромбоцитов. В своей работе молекулы VWF были обездвижены на поверхности микрофлюидного канала через взаимодействия биотин-стрептавидина и изображены под общей внутренней флуоресценцией (TIRF) микроскопии при различных средах потока сдвига17. Применяя аналогичный метод, как Фу, мы здесь продемонстрировать, что конформации VWF и лямбда ДНК могут быть непосредственно наблюдались как при TIRF и конфокальной флуоресценции микроскопии. Как показано на рисунке 1,микрофлюидные устройства используются для создания и контроля потока сдвига, а биомолекулы обездвижены на поверхности канала. При применении различных ставок сдвига регистрируются конформации одной и той же молекулы для измерения прорезной длины, также показанной на рисунке 1. Этот метод может быть широко применен для изучения других полимерных поведений в сложных условиях потока как для реологических, так и для биологических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для получения высококачественных данных одномолекулярных конформационных изменений с помощью флуоресценционной микроскопии, описанной в этом методе, очень важно инкубировать молекулу в течение соответствующего количества времени, минимизировать ее неспецифические взаимодействия…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда DMS-1463234, Национальными институтами здравоохранения, грантами HL082808 и AI133634, а также внутренним финансированием Университета Лихай.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
