Karaktäriserande konformationsförändringar med en molekyl under skjuvningsflöde med fluorescensmikroskopi
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att immobilisera enskilda makromolekyler i mikrofluidiska enheter och kvantifiera förändringar i deras konformationer under skjuvningsflöde. Detta protokoll är användbart för att karakterisera biomekaniska och funktionella egenskaper biomolekyler såsom proteiner och DNA i en flödesmiljö.
Abstract
Enmolekylsbeteende under mekanisk störning har karakteriserats brett för att förstå många biologiska processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har dock begränsad tidsupplösning, medan Förster resonansenergiöverföring (FRET) endast gör det möjligt att dra slutsatsen att konformationer härleds. Fluorescensmikroskopi, å andra sidan, möjliggör realtidsinsitu visualisering av enstaka molekyler i olika flödesförhållanden. Vårt protokoll beskriver stegen för att fånga konformationella förändringar av enskilda biomolekyler under olika skjuvflödesmiljöer med fluorescensmikroskopi. Skjuvflödet skapas inuti mikrofluidiska kanaler och styrs av en sprutpump. Som demonstrationer av metoden, von Willebrand faktor (VWF) och lambda DNA är märkta med biotin och fluorofor och sedan immobiliseras på kanalytan. Deras konformationer övervakas kontinuerligt under variabelsk skjuvningsflöde med hjälp av total inre reflektion (TIRF) och konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversibla unraveling dynamikVWF är användbara för att förstå hur dess funktion regleras i mänskligt blod, medan konformationen av lambda DNA ger insikter i biofysik makromolekyler. Protokollet kan också tillämpas i stor utsträckning för att studera polymerernas beteende, särskilt biopolymerer, i varierande flödesförhållanden och undersöka reologi av komplexa vätskor.
Introduction
Mekanismer för hur biomolekyler reagerar på miljöstimuli har studerats brett. I en flödesmiljö i synnerhet reglerar skjuvning och långsträckningskrafter konformationsförändringarna och potentiellt biomolekylernas funktion. Typiska exempel är skjuvning-inducerad upplösning av lambda DNA och von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har använts som ett verktyg för att förstå konformationsdynamiken hos enskilda, flexibla polymerkedjor och reologi av polymerlösningar1,2,3,4. VWF är en naturlig flödessensor som aggregerar blodplättar på sårplatser av blodkärl med onormal skjuvning och flödesmönster. Reda ut VWF är viktigt för att aktivera bindningen av blodplättar till A1-domänen och kollagenbindning till A3-domänen. Dessutom tillåter hög skjuvning-inducerad A2 domän utspelar sig klyvning av VWF, som reglerar dess molekylära viktfördelning i omlopp5,6. Således kan direkt visualisering av hur dessa molekyler bete sig under flöde avsevärt förbättra vår grundläggande förståelse för deras biomekanik och funktion, vilket i sin tur kan möjliggöra nya diagnostiska och terapeutiska tillämpningar.
Typiska metoder för att karakterisera enmolekylkonformationer inkluderar optiska/magnetiska pincett, atomkraftmikroskopi (AFM) och enmolekyl Förster resonans energiöverföring (FRET)7. Enmolekylkraftspektroskopi är ett kraftfullt verktyg för att undersöka kraften och rörelsen i samband med de konformationella förändringarna av biomolekyler. Den saknar dock förmågan att kartlägga övergripande molekylära konformationer8. AFM kan avbildning med hög rumslig upplösning men är begränsad i tidsupplösning9,10. Dessutom kan kontakten mellan spetsen och provet förvirra svaret som induceras av flöde. Andra metoder som FRET och nanopore analytics bestämma enmolekyl protein vikning och utfällbara tillstånd baserat på detektion av intramolekylära avstånd och uteslutna volymer. Dessa metoder är dock fortfarande i sin linda och begränsad i sin direkta observation av enmolekylkonformationer11,12,13,14.
Å andra sidan har direkt observera makromolekyler med hög tidsmässig och rumslig upplösning under fluorescensmikroskopi förbättrat vår förståelse av enmolekyldynamik i många biologiska processer15,16. Till exempel, Fu et al. nyligen uppnått samtidig visualisering av VWF förlängning och trombocytreceptorbindning för första gången. I sitt arbete, VWF molekyler var immobiliserade på ytan av en mikrofluidisk kanal genom biotin-streptavidin interaktioner och avbilds under total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi vid varierande skjuvning flöde miljöer17. Tillämpa en liknande metod som Fu’s, visar vi här att konformationer av VWF och lambda DNA kan observeras direkt under både TIRF och confocal fluorescens mikroskopi. Som visas i figur 1används mikrofluidiska enheter för att skapa och kontrollera skjuvningsflödet, och biomolekyler na immobiliseras på kanalytan. Vid applicering av varierande skjuvningsfrekvens registreras konformationer av samma molekyl för att mäta förlängningslängden, som också visas i figur 1. Metoden kan användas i stor utsträckning för att utforska andra polymerbeteenden under komplexa flödesmiljöer för både reologiska och biologiska studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att få högkvalitativa data av konformationsförändringar av enmolekyl med fluorescensmikroskopi enligt beskrivningen i denna metod är det viktigt att inkubera molekylen under lämplig tid, minimera dess ospecifika interaktioner med ytan och fastställa mikroskopinställningar som minskar fotoblekning. Molekylens förmåga att fritt ändra konformation är relaterad till antalet interaktioner mellan biotinstreptavidin som bildas mellan molekylen och ytan. Som tidigare nämnts måste detta kontrolleras genom att i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av en National Science Foundation bevilja DMS-1463234, National Institutes of Health bidrag HL082808 och AI133634, och Lehigh University intern finansiering.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
