腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証
Summary
ここで提示するプロトコルは、皮質腎臓抽出物調製および全タンパク質正常化を利用して、哺乳動物腎臓における血管内皮成長因子と黄体形成ホルモンとの相関関係を実証するためのプロトコルである。
Abstract
血管内皮増殖因子(VEGF)は、腎臓の血管新生および血管透過性を制御するのに役立つ。糖尿病性腎症などの腎疾患は、腎臓におけるVEGF調節不全と関連している。腎臓の生理学的条件下でVEGFを支配する因子はよく理解されていません。前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、生殖器官の生理学的VEGF発現を調節するのに役立ちます。LH受容体が腎臓に見つかっていることを考えると、私たちは、ジーチック研究所で、LHも腎臓のVEGF発現を調節するのに役立つと仮定しています。証拠を提供するために、我々はLHレベルが哺乳動物腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的とした。腎臓を含むほとんどのVEGF関連の調査は、モデルとして低次哺乳動物(すなわち、げっ歯類とウサギ)を使用しています。この研究を人体に翻訳するために、高次哺乳動物(ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べることにした。このプロトコルは、腎皮質からの総タンパク質リサートを使用します。この方法の成功の鍵は、死後すぐに食肉処理場の動物からの腎臓の調達だけでなく、総タンパク質による検体レベル(腎臓抽出物中)の正常化が含まれます。この研究は、ウシとブタの両方の腎臓におけるLHとVEGFの間の有意な線形関係を示すに成功した。結果は2つの異なる種で再現可能である。この研究は、牛や豚からの腎臓抽出物の使用が、特にVEGFと他のアナライトとの相関関係を調べるために、腎生理学の研究のための優れた、経済的、豊富な資源であることを支持する証拠を提供する。
Introduction
血管内皮増殖因子A(VEGF-A)は、腎臓および他の器官1、2における血管新生および血管透過性を調節するのに役立つ(以下、VEGF−AはVEGFと呼ばれる)。腎臓のVEGFレベルは、厳格な恒静制御下にある。腎VEGFレベルが上昇または抑制されると、腎臓が機能不全を起こす可能性があります。例えば、出生後3週間以内に、VEGFに対するポドサイト特異的ヘテロ接合性を有するマウスは、子宮内皮症および無血球体(すなわち、ヒト子癇前症に見られる腎病変)を発症し、そして最終段階の腎不全は生後3ヶ月までにこれらのヘテロジゴスで起こる。ポドサイト特異的ホモ接合性ノックアウトは、生後1日以内に水腫および腎不全で死亡する3,4.
一方、腎VEGFの過剰発現は、タンパク尿および糸球体肥大3、4を引き起こす。例えば、VEGFを過剰発現するトランスジェニックウサギは、腎症の初期段階で糸球体濾過率の増加を伴う進行性タンパク尿を示し、続いて後の段階3で糸球体濾過率の低下を示す。糖尿病成人における末期腎疾患の主な原因である糖尿病性腎症は、VEGF調節不全2、5に強く関連している。病理学的条件下でVEGF発現を誘導する際の低酸素症の役割に多大な注意が払われている5.しかしながら、生理学的条件下でVEGFを支配する因子(腎臓および他の器官の両方)は、よく理解されていない2、6。生理学的および病理学的VEGF調節に関与するこれらの因子(酸素を除く)を同定することは重要な取り組みである。
前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、卵巣および精巣7、8などの生殖器官における生理学的VEGF発現を調節するのに役立つ。以前の研究は、LHはまた、目6、9、10などの非生殖器官のVEGFを調節するのに役立つという証拠を提供しています。LH受容体は、腎臓11、12の髄質および皮質に見られる。なお、腎尿細管上皮細胞は、LH受容体と同様に、VEGF11、12、13、14を発現する。これら2つの観察を一緒に取り、我々はLHが腎臓13、14のVEGF発現を調節するのにも役立つと仮定した。このLH/VEGF関係の証拠を提供するために、提示されたプロトコルは、LHレベルが腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的としています。腎臓に関する多くの以前のVEGF関連の調査は、低次哺乳動物モデル(すなわち、げっ歯類およびウサギ)2を使用している。この研究を人体に翻訳するために、この研究は、高次哺乳動物(ここでは、ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べる。この目的を遂行するために、ウシおよびブタ腎臓の皮質領域から総タンパク質リサートを調製した。
Protocol
Representative Results
Discussion
動物の死の直後にアバトワールから腎臓を調達することは、この方法論の成功の鍵です。これは、人間の死体の代わりに牛や豚からの臓器を利用する主な利点です。通常、死亡時からヒトの死体器官が調達されるまで、少なくとも12〜24時間の遅延がある。身体器官の化学組成は2時間後の死後15、16内で有意に変化するので、ヒト死体腎におけるVEGF?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、牛と豚の腎臓を提供したショルのスローターハウス(ブリスフィールド、MI)に感謝します。この研究には助成金は使われていた。
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
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