Aantonen van een lineaire relatie tussen vasculaire endotheliale groei factor en luteïniserend hormoon in nier schors extracten
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor het gebruik van een corticale nier extract voorbereiding en totale eiwit normalisatie om de correlatie tussen vasculaire endotheliale groeifactor en luteïniserend hormoon in de nier van zoogdieren demonstreren.
Abstract
Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) helpt bij het beheersen van de angiogenese en vasculaire permeabiliteit in de nier. Nieraandoeningen, zoals diabetische nefropathie, worden geassocieerd met VEGF-disregulatie in de nier. De factoren die VEGF beheersen onder fysiologische omstandigheden in de nier zijn niet goed begrepen. Luteïniserend hormoon (LH), een Pro-angiogenic hormoon, helpt bij het reguleren van de fysiologische VEGF expressie in voortplantingsorganen. Gezien het feit dat LH receptoren zijn gevonden in de nier, wij, bij Zietchick Research Institute, veronderstelde hier dat LH ook helpt reguleren VEGF expressie in de nier zo goed. Om bewijs te leveren, hebben we erop gericht om te laten zien dat LH-niveaus VEGF-niveaus in de nier van zoogdieren kunnen voorspellen. De meeste VEGF-gerelateerde onderzoeken met betrekking tot de nier hebben lagere zoogdieren gebruikt als modellen (d.w.z. knaagdieren en konijnen). Om dit werk te vertalen naar het menselijk lichaam, werd besloten om de relatie tussen VEGF en LH in de hogere orde zoogdieren (d.w.z. runderen en varkens modellen) te onderzoeken. Dit protocol maakt gebruik van het totale eiwit lysaat uit de nierschors. De sleutels van het succes van deze methode omvatten de aanschaf van nieren van slachterij dieren onmiddellijk na de dood evenals normalisatie van de analyt niveaus (in het nierextract) door totaal eiwit. Deze studie toont met succes een significante lineaire relatie aan tussen LH en VEGF bij zowel runderen als varkens nieren. De resultaten zijn reproduceerbaar in twee verschillende soorten. De studie biedt ondersteunend bewijs dat het gebruik van nierextracten van koeien en varkens een uitstekende, economische en overvloedige bron is voor de studie van nierfysiologie, met name voor het onderzoeken van de correlatie tussen VEGF en andere analyten.
Introduction
Vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGF-a), helpt bij het reguleren van angiogenese en vasculaire permeabiliteit in de nier en andere organen1,2(hierna wordt VEGF-a aangeduid als VEGF). VEGF-niveaus in de nier zijn onder strakke homeostatische controle. Wanneer de renale VEGF-niveaus verhoogd of depressief zijn, kan de nier defect raken. Bijvoorbeeld, binnen 3 weken na de geboorte, muizen met podocyte-specifieke heterozygositeit voor VEGF ontwikkelen endotheliose en bloedloze glomeruli (dat wil zeggen, nierlaesies waargenomen bij menselijke preeclampsie), en eindstadium nierfalen treedt op in deze heterozygoten door 3 maanden oud. Podocyte-specifieke homo zygotische Knockouts sterven aan hydrops en nierfalen binnen 1 dag na de geboorte3,4.
Aan de andere kant veroorzaakt overexpressie van renale VEGF Proteïnurie en glomerulaire hypertrofie3,4. Bijvoorbeeld, transgene konijnen die VEGF vertonen vertonen progressieve Proteïnurie met verhoogde glomerulaire filtratie snelheden in vroege stadia van nefropathie, gevolgd door verminderde glomerulaire filtratie snelheden in latere stadia3. Diabetische nefropathie, een belangrijke oorzaak van eindstadium nierziekte bij diabetische volwassenen, wordt sterk geassocieerd met VEGF disregulatie2,5. Er is veel aandacht besteed aan de rol van hypoxie bij het induceren van VEGF-expressie onder pathologische omstandigheden5. Echter, de factoren voor VEGF onder fysiologische omstandigheden (zowel in de nier en andere organen) zijn niet goed begrepen2,6. Het identificeren van deze factoren (met uitzondering van zuurstof) die betrokken zijn bij fysiologisch en pathologisch VEGF-regelgeving is een belangrijke onderneming.
Luteïniserend hormoon (LH), een Pro-angiogenic hormoon, helpt bij het reguleren van de fysiologische VEGF expressie in voortplantingsorganen zoals de eierstok en testis7,8. Eerdere studies hebben aangetoond dat LH ook helpt bij het reguleren van VEGF in niet-voortplantingsorganen, zoals de ogen6,9,10. LH-receptoren zijn te vinden in de Medulla en cortex van de nier11,12. Van noot, niertubulaire epitheliale cellen, evenals de LH-receptor, Express VEGF11,12,13,14. Met deze twee observaties samen, we veronderstelde dat LH ook helpt reguleren VEGF expressie in de nier13,14. Om het bewijs te leveren van deze LH/VEGF-relatie, heeft het gepresenteerde protocol tot doel te laten zien dat LH-niveaus in staat zijn om VEGF-niveaus in de nier te voorspellen. Veel eerdere VEGF-gerelateerde onderzoeken met betrekking tot de nier hebben gebruik gemaakt van lagere orde zoogdieren modellen (d.w.z. knaagdieren en konijnen)2. Om dit werk te vertalen naar het menselijk lichaam, onderzoekt de studie de relatie tussen VEGF en LH in de hogere orde zoogdieren (hier, runderen en varkens modellen). Om dit doel te realiseren, werd totaal eiwit lysaat bereid uit de cortex-regio van runderen en varkens nieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het aanschaffen van de nieren uit de slachterij onmiddellijk na de dood van dieren is de sleutel tot succes in deze methodologie. Dit is het belangrijkste voordeel van het gebruik van organen van koeien en varkens in plaats van menselijke cadavers. Er is meestal ten minste een 12-24 h vertraging van de tijd van de dood totdat menselijke kadaver organen worden verkregen. Omdat de chemische samenstelling van de lichaamsorganen significant verandert binnen 2 h post-mortem15,<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het slachthuis van Scholl (Blissfield, MI) voor het leveren van de runderen en varkens nieren. Voor deze studie werd geen subsidiefinanciering gebruikt.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neurosciences. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
