Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte
Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll für die Verwendung einer kortikalen Nierenextrakt Präparat und Gesamtprotein Normalisierung, um die Korrelation zwischen vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor und luteinisierendes Hormon in der Säugetierniere zu demonstrieren.
Abstract
Vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) hilft, Angiogenese und vaskuläre Durchlässigkeit in der Niere zu kontrollieren. Nierenerkrankungen, wie diabetische Nephropathie, sind mit VEGF-Dysregulation in der Niere verbunden. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen in der Niere regieren, sind nicht gut verstanden. Luteinizing Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen zu regulieren. Da LH-Rezeptoren in der Niere gefunden werden, haben wir am Zietchick Research Institute hier vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in der Niere zu regulieren. Um Beweise zu liefern, wollten wir zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Säugetierniere vorherzusagen. Bei den meisten VEGF-bezogenen Untersuchungen mit der Niere wurden Säugetiere niedrigerer Ordnung als Modelle verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen). Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, wurde beschlossen, die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (d. h. Rinder- und Schweinemodelle) zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet das gesamte Proteinlysat aus dem Nierenkortex. Zu den Schlüsseln zum Erfolg dieser Methode gehören die Beschaffung von Nieren von Schlachthoftieren unmittelbar nach dem Tod sowie die Normalisierung des Analytspiegels (im Nierenextrakt) durch das Gesamtprotein. Diese Studie zeigt erfolgreich eine signifikante lineare Beziehung zwischen LH und VEGF sowohl bei Rinder- als auch in Schweinenieren. Die Ergebnisse sind in zwei verschiedenen Arten reproduzierbar. Die Studie liefert Belege dafür, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete, wirtschaftliche und reichlich vorhandene Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere zur Untersuchung der Korrelation zwischen VEGF und anderen Analyten.
Introduction
Vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), hilft, Angiogenese und vaskuläre Permeabilität in der Niere und anderen Organen1,2 (im Folgenden WIRD VEGF-A als VEGF bezeichnet werden) zu regulieren. VEGF-Spiegel in der Niere sind unter strenger panostatischer Kontrolle. Wenn die VEGF-Spiegel der Nieren erhöht oder depressiv sind, kann die Niere fehlamwerden. Zum Beispiel entwickeln Mäuse mit podozytspezifischer Heterozygosität für VEGF innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt Endotheliose und blutlose Glomeruli (d. h. Nierenläsionen, die bei menschlicher Präeklampsie beobachtet werden), und Nierenversagen im Endstadium tritt in diesen Heterozygoten im Alter von 3 Monaten auf. Podozyten-spezifische homozygote Knockouts sterben an Hydrops und Nierenversagen innerhalb von 1 Tag nach der Geburt3,4.
Auf der anderen Seite verursacht überexpression von renalem VEGF Proteinurie und glomeruläre Hypertrophie3,4. Zum Beispiel zeigen transgene Kaninchen, die VEGF überexpressen, progressive Proteinurie mit erhöhten glomerulären Filtrationsraten in frühen Stadien der Nephropathie, gefolgt von verringerten glomerulären Filtrationsraten in späteren Stadien3. Diabetische Nephropathie, eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium bei diabetischen Erwachsenen, ist stark mit VEGF-Dysregulation2,5verbunden. Der Rolle der Hypoxie bei der Induktion der VEGF-Expression unter pathologischen Bedingungen wurde große Aufmerksamkeit gewidmet5. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen (sowohl in der Niere als auch in anderen Organen) beeinflussen, sind jedoch nicht gut verstanden2,6. Die Identifizierung dieser Faktoren (mit Ausnahme von Sauerstoff), die an der physiologischen und pathologischen VEGF-Regulierung beteiligt sind, ist ein wichtiges Unterfangen.
Luteinisierendes Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, die physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen wie Eierstock und Hoden7,8zu regulieren. Frühere Studien haben Beweise dafür erbracht, dass LH auch hilft, VEGF in nicht-reproduktiven Organen zu regulieren, wie die Augen6,9,10. LH-Rezeptoren finden sich in der Medulla und Demkorteder der Niere11,12. Bemerkenswert ist, dass nierenröhrenförmige Epithelzellen sowie der LH-Rezeptor VEGF11,12,13,14ausdrücken. Unter Berücksichtigung dieser beiden Beobachtungen haben wir vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in derNiere zuregulieren 13,14. Um Beweise für diese LH/VEGF-Beziehung zu liefern, soll das vorgestellte Protokoll zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Niere vorherzusagen. Viele frühere VEGF-bezogene Untersuchungen mit der Niere haben Säugetiermodelle niedrigerer Ordnung verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen)2. Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, untersucht die Studie die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (hier Rinder- und Schweinemodelle). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Gesamteproteinlysat aus der Kortexregion von Rinder- und Schweinenieren hergestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Beschaffung von Nieren aus dem Schlachthof unmittelbar nach dem Tod der Tiere ist der Schlüssel zum Erfolg in dieser Methodik. Dies ist der Hauptvorteil der Verwendung von Organen von Kühen und Schweinen anstelle von menschlichen Leichen. Es gibt in der Regel mindestens eine Verzögerung von 12-24 h vom Zeitpunkt des Todes bis zur Beschaffung menschlicher Kadaverorgane. Da sich die chemische Zusammensetzung der Körperorgane innerhalb von 2 h postmortal15,16</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Scholl es Slaughterhouse (Blissfield, MI) für die Bereitstellung der Rinder- und Schweinenieren. Für diese Studie wurden keine Fördermittel in Höhe von zuschüssen mitteln verwendet.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
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