Demonstrando uma relação linear entre fator de crescimento endotelial vascular e hormônio luteinizador em extratos de córtex renal
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a utilização de uma preparação de extrato renal cortical e normalização total da proteína para demonstrar a correlação entre fator de crescimento endotelial vascular e hormônio luteinizador no rim de mamíferos.
Abstract
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ajuda a controlar a angiogênese e a permeabilidade vascular no rim. Distúrbios renais, como nefropatia diabética, estão associados à desregulação do VEGF no rim. Os fatores que regem o VEGF em condições fisiométricas no rim não são bem compreendidos. O hormônio luteinizador (LH), um hormônio pró-angiogênico, ajuda a regular a expressão fisiométrica vegf em órgãos reprodutivos. Dado que os receptores De LH são encontrados no rim, nós, no Instituto de Pesquisa Zietchick, hipotetizar aqui que LH também ajuda a regular a expressão VEGF no rim também. Para fornecer evidências, visamos mostrar que os níveis de LH são capazes de prever os níveis de VEGF no rim de mamíferos. A maioria das investigações relacionadas ao VEGF envolvendo o rim têm usado mamíferos de ordem inferior como modelos (ou seja, roedores e coelhos). Para traduzir este trabalho para o corpo humano, decidiu-se examinar a relação entre VEGF e LH em mamíferos de ordem superior (ou seja, modelos bovinos e suínos). Este protocolo usa o lisato total da proteína do córtex do rim. As chaves para o sucesso deste método incluem a aquisição de rins de animais de matadouro imediatamente após a morte, bem como a normalização dos níveis de anrósteria (no extrato renal) por proteína total. Este estudo demonstra com sucesso uma relação linear significativa entre LH e VEGF em ambos os rins bovinos e suínos. Os resultados são reproduzíveis em duas espécies diferentes. O estudo fornece evidências de que o uso de extratos renais de vacas e porcos é um excelente recurso econômico e abundante para o estudo da fisiologia renal, particularmente para examinar a correlação entre o VEGF e outros analítes.
Introduction
O fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), ajuda a regular a angiogênese e permeabilidade vascular no rim e outros órgãos1,2 (a seguir, o VEGF-A será referido como VEGF). Os níveis de VEGF no rim estão controle homeostático apertado. Quando os níveis renais de VEGF são elevados ou deprimidos, o rim pode funcionar mal. Por exemplo, dentro de 3 semanas após o nascimento, camundongos com heterozigosidade específica de podocito para VEGF desenvolvem endotelrose e glomeruli sem derramamento de sangue (ou seja, lesões renais observadas na pré-eclâmpsia humana) e insuficiência renal em estágio terminal ocorre nesses heterozigotos em 3 meses de idade. Nocautes homozigóticos específicos de podocito morrem de hidrops e insuficiência renal dentro de 1 dia após o nascimento3,4.
Por outro lado, a superexpressão do VEGF renal causa proteinúria e hipertrofia glomerular3,4. Por exemplo, coelhos transgênicos que superexpressam vegf exibem proteinúria progressiva com aumento das taxas de filtragem glomerular nos estágios iniciais da nefropatia, seguido pela diminuição das taxas de filtragem glomerular em estágios posteriores3. A nefropatia diabética, principal causa de doença renal em estágio terminal em adultos diabéticos, está fortemente associada à desregulaçãovegf 2,5. Muita atenção tem sido dada ao papel da hipóxia na indução da expressão vegf condições patológicas5. No entanto, os fatores que regem o VEGF em condições fisiométricas (tanto no rim quanto em outros órgãos) não são bem compreendidos2,6. Identificar esses fatores (exceto oxigênio) que estão envolvidos na regulação fisiológica e patológica do VEGF é um empreendimento importante.
Hormônio luteinizador (LH), um hormônio pró-angiogênico, ajuda a regular a expressão fisiométrica VEGF em órgãos reprodutivos, como o ovário e testículo7,8. Estudos anteriores forneceram evidências de que a LH também ajuda a regular o VEGF em órgãos não reprodutivos, como os olhos6,9,10. LH receptores são encontrados na medula e córtex do rim11,12. De nota, as células epiteliais tubulares, bem como o receptor LH, expressam VEGF11,12,13,14. Tomando estas duas observações junto, nós supor que LH igualmente ajuda a regular a expressão de VEGF no rim13,14. Para fornecer evidências dessa relação LH/VEGF, o protocolo apresentado visa mostrar que os níveis de LH são capazes de prever os níveis de VEGF no rim. Muitas investigações anteriores relacionadas ao VEGF envolvendo o rim usaram modelos de mamíferos de ordem inferior (ou seja, roedores e coelhos)2. Para traduzir este trabalho para o corpo humano, o estudo examina a relação entre VEGF e LH em mamíferos de maior ordem (aqui, modelos bovinos e suínos). Para realizar esse objetivo, o lisato total de proteínas foi preparado a partir da região do córtex dos rins bovinos e suínos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aquisição de rins do matadouro imediatamente após a morte animal é a chave para o sucesso nesta metodologia. Esta é a principal vantagem de utilizar órgãos de vacas e porcos em vez de cadáveres humanos. Geralmente há pelo menos um atraso de 12-24 h a partir da hora da morte até que os órgãos de cadáveres humanos são adquiridos. Como a composição química dos órgãos corporais muda significativamente dentro de 2 h post-mortem15,16,VEGF-estudos e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem slaughterhouse Scholl (Blissfield, MI) para fornecer os rins bovinos e suínos. Nenhum financiamento de subvenção foi utilizado para este estudo.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
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