Demostrar una relación lineal entre el factor de crecimiento endotelial vascular y la hormona luteinizante en extractos de corteza renal
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la utilización de una preparación de extracto renal cortical y la normalización total de proteínas para demostrar la correlación entre el factor de crecimiento endotelial vascular y la hormona luteinizante en el riñón de mamífero.
Abstract
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ayuda a controlar la angiogénesis y la permeabilidad vascular en el riñón. Los trastornos renales, como la nefropatía diabética, se asocian con la desregulación del VEGF en el riñón. Los factores que rigen el VEGF bajo condiciones fisiológicas en el riñón no se entienden bien. La hormona luteinizante (LH), una hormona pro-angiogénica, ayuda a regular la expresión fisiológica de VEGF en los órganos reproductivos. Dado que los receptores de LH se encuentran en el riñón, nosotros, en el Instituto de Investigación Zietchick, hipotetizó aquí que LH también ayuda a regular la expresión de VEGF en el riñón también. Para proporcionar evidencia, nuestro objetivo era demostrar que los niveles de LH son capaces de predecir los niveles de VEGF en el riñón de mamíferos. La mayoría de las investigaciones relacionadas con el VEGF relacionadas con el riñón han utilizado mamíferos de orden inferior como modelos (es decir, roedores y conejos). Para traducir este trabajo al cuerpo humano, se decidió examinar la relación entre VEGF y LH en mamíferos de mayor orden (es decir, modelos bovinos y porcinos). Este protocolo utiliza el lisado total de proteína de la corteza renal. Las claves del éxito de este método incluyen la adquisición de riñones de animales de matadero inmediatamente después de la muerte, así como la normalización de los niveles de analito (en el extracto renal) por proteína total. Este estudio demuestra con éxito una relación lineal significativa entre LH y VEGF en los riñones bovino y porcino. Los resultados son reproducibles en dos especies diferentes. El estudio proporciona evidencia de apoyo de que el uso de extractos renales de vacas y cerdos son un recurso excelente, económico y abundante para el estudio de la fisiología renal, particularmente para examinar la correlación entre el VEGF y otros analitos.
Introduction
El factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), ayuda a regular la angiogénesis y la permeabilidad vascular en el riñón y otros órganos1,2 (en adelante, el VEGF-A se denominará VEGF). Los niveles de VEGF en el riñón están bajo un estricto control homeostático. Cuando los niveles de VEGF renal son elevados o deprimidos, el riñón puede funcionar mal. Por ejemplo, dentro de las 3 semanas después del nacimiento, los ratones con heterocigosidad específica de podocitos para el VEGF desarrollan endotelisis y glomérulos sin sangre (es decir, lesiones renales que se ven en la preeclampsia humana), y la insuficiencia renal terminal se produce en estos heterocigotos a los 3 meses de edad. Los noqueos homocigoticos específicos de los podocitos mueren a causa de los hispé y la insuficiencia renal dentro de 1 día del nacimiento3,4.
Por otro lado, la sobreexpresión del VEGF renal causa proteinuria e hipertrofia glomerular3,4. Por ejemplo, los conejos transgénicos que sobreexpresan el VEGF presentan proteinuria progresiva con mayores tasas de filtración glomerular en las primeras etapas de nefropatía, seguidas de la disminución de las tasas de filtración glomerular en etapas posteriores3. La nefropatía diabética, una de las principales causas de la enfermedad renal terminal en adultos diabéticos, está fuertemente asociada con la desregulación VEGF2,5. Se ha prestado mucha atención al papel de la hipoxia en la inducción de la expresión VEGF en condiciones patológicas5. Sin embargo, los factores que rigen el VEGF en condiciones fisiológicas (tanto en el riñón como en otros órganos) no se entienden bien2,6. Identificar estos factores (excepto el oxígeno) que están involucrados en la regulación fisiológica y patológica del VEGF es una empresa importante.
La hormona luteinizante (LH), una hormona pro-angiogénica, ayuda a regular la expresión fisiológica de VEGF en órganos reproductivos como el ovario y testis7,8. Estudios anteriores han proporcionado evidencia de que LH también ayuda a regular el VEGF en órganos no reproductivos, como los ojos6,9,10. Los receptores LH se encuentran en la médula y la corteza del riñón11,12. Cabe destacar que las células epiteliales tubulares renales, así como el receptor LH, expresa VEGF11,12,13,14. Tomando estas dos observaciones juntas, hipotetizó que LH también ayuda a regular la expresión de VEGF en el riñón13,14. Para proporcionar evidencia de esta relación LH/VEGF, el protocolo presentado tiene como objetivo mostrar que los niveles de LH son capaces de predecir los niveles de VEGF en el riñón. Muchas investigaciones anteriores relacionadas con el VEGF relacionadas con el riñón han utilizado modelos de mamíferos de orden inferior (es decir, roedores y conejos)2. Para traducir este trabajo al cuerpo humano, el estudio examina la relación entre VEGF y LH en mamíferos de mayor orden (aquí, modelos bovinos y porcinos). Para llevar a cabo este objetivo, se preparó un lisato proteico total a partir de la región de la corteza de los riñones bovino y porcino.
Protocol
Representative Results
Discussion
La adquisición de riñones del matadero inmediatamente después de la muerte animal es la clave del éxito en esta metodología. Esta es la principal ventaja de utilizar órganos de vacas y cerdos en lugar de cadáveres humanos. Por lo general, hay al menos un retraso de 12-24 h desde el momento de la muerte hasta que se adquieren los órganos de cadáveres humanos. Debido a que la composición química de los órganos corporales cambia significativamente dentro de 2 h post-mortem15,<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al matadero de Scholl (Blissfield, MI) por proporcionar los riñones bovino y porcino. No se utilizó financiación de subvenciones para este estudio.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
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