Visar ett linjärt samband mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och luteiniserande hormon i njure cortex extrakt
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utnyttja en kortikal njure extrakt beredning och totalprotein normalisering för att demonstrera sambandet mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och luteiniserande hormon i däggdjurs njure.
Abstract
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) hjälper till att kontrollera angiogenes och vaskulär permeabilitet i njuren. Njursjukdomar, såsom diabetesnefropati, är förknippade med VEGF dysreglering i njuren. De faktorer som styr VEGF under fysiologisk tillstånd i njuren är inte väl förstådda. Luteiniserande hormon (LH), ett proangiogent hormon, hjälper till att reglera fysiologisk VEGF-uttryck i reproduktionsorgan. Med tanke på att LH-receptorer finns i njuren, vi, på Zietchick Research Institute, hypotes här att LH hjälper också reglera VEGF uttryck i njuren samt. För att bevisa, syftade vi till att visa att LH-nivåer har möjlighet att förutsäga VEGF nivåer i däggdjurs njure. De flesta VEGF-relaterade undersökningar som involverar njuren har använt lägre ordning däggdjur som modeller (dvs gnagare och kaniner). För att översätta detta arbete till den mänskliga kroppen, beslutades det att undersöka förhållandet mellan VEGF och LH i högre ordning däggdjur (dvs., nötkreatur och svin modeller). Detta protokoll använder den totala proteinlysat från njurcortex. Nycklarna till denna metod framgång inkluderar anskaffning av njurar från slakteri djur omedelbart efter döden samt normalisering av analyt nivåer (i njure extraktet) av totalprotein. Denna studie visar framgångsrikt ett betydande linjärt samband mellan LH och VEGF i både nötkreatur och svin njurar. Resultaten är reproducerbara i två olika arter. Studien ger stödjande belägg för att användningen av njure extrakt från kor och grisar är en utmärkt, ekonomisk, och riklig resurs för studiet av njurfysiologi, särskilt för att undersöka sambandet mellan VEGF och andra analyter.
Introduction
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor a (VEGF-a), hjälper till att reglera angiogenes och vaskulär permeabilitet i njurarna och andra organ1,2(hädanefter , VEGF-a kommer att kallas VEGF). VEGF-nivåerna i njuren är under stram homeostatisk kontroll. När renal VEGF-nivåerna är förhöjda eller deprimerade, kan njuren fungera dåligt. Till exempel, inom 3 veckor efter födseln, möss med podocyte-specifik heterozygosity för VEGF utveckla endotelios och blodfria glomeruli (dvs, njurlesioner ses i mänsklig preeclampsi), och slutstadiet njursvikt förekommer i dessa heterozygoter av 3 månaders ålder. Podocyte-specifika homozygotiska Knockouts dör från hydrops och njursvikt inom 1 födelse dagen3,4.
Å andra sidan, överuttryck av renal VEGF orsakar proteinuri och glomerulär hypertrofi3,4. Till exempel, transgena kaniner som överuttrycker VEGF uppvisar progressiv Proteinuri med ökad glomerulär filtrationshastighet i tidiga stadier av nefropati, följt av minskad glomerulär filtrationshastighet i senare steg3. Diabetesnefropati, en viktig orsak till slutstadiet njursjukdom hos diabetiker vuxna, är starkt förknippad med VEGF dysreglering2,5. En hel del uppmärksamhet har betalats till rollen av hypoxi att inducera VEGF uttryck under patologiska villkor5. Emellertid är faktorerna som reglerar VEGF under fysiologiskt villkorar (både i njure och andra organ) inte väl förstådda2,6. Att identifiera dessa faktorer (förutom syre) som är involverade i fysiologisk och patologisk VEGF-reglering är ett viktigt företag.
Luteiniserande hormon (LH), ett proangiogent hormon, hjälper till att reglera fysiologisk VEGF-uttryck i reproduktionsorgan som äggstockarna och testiklarna7,8. Tidigare studier har gett belägg för att LH också hjälper till att reglera VEGF i icke-reproduktionsorgan, såsom ögon6,9,10. LH-receptorer finns i medulla och cortex av njure11,12. Av anmärkning, njurtubulär epitelceller, samt LH-receptorn, Express VEGF11,12,13,14. Med dessa två observationer tillsammans, vi hypotesen att LH också hjälper till att reglera VEGF uttryck i njuren13,14. För att bevisa detta LH/VEGF-förhållande syftar det presenterade protokollet till att visa att LH-nivåerna kan förutsäga VEGF-nivåer i njuren. Många tidigare VEGF-relaterade utredningar som involverar njuren har använt lägre ordningens däggdjurs modeller (dvs gnagare och kaniner)2. För att översätta detta arbete till den mänskliga kroppen, undersöker studien förhållandet mellan VEGF och LH i högre ordning däggdjur (här, nötkreatur och svin modeller). För att genomföra detta mål, total proteinlysat utarbetades från cortex regionen av nötkreatur och svin njurar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att skaffa njurar från slakteriet omedelbart efter djurens död är nyckeln till framgång i denna metodik. Detta är den största fördelen med att utnyttja organ från kor och grisar i stället för mänskliga kadaver. Det finns vanligtvis minst en 12-24 h fördröjning från tidpunkten för döden tills mänskliga kadaver organ upphandlas. Eftersom den kemiska sammansättningen av kroppsliga organ avsevärt förändras inom 2 h post-mortem15,16, VEGF-studier …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Scholl ‘ s slakteri (Blissfield, MI) för att tillhandahålla nötkreatur och svin njurar. Ingen bidragsfinansiering utnyttjades för denna studie.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neurosciences. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
