Böbrek Korteks Ekstrelerinde Vasküler EndotelBüyüme Faktörü ile Luteinizan Hormon Arasında Doğrusal İlişki Nin Gösterilmesi
Summary
Burada sunulan bir kortikal böbrek ekstresi hazırlık ve toplam protein normalizasyonu vasküler endotelyal büyüme faktörü ve memeli böbrek luteinizing hormon arasındaki korelasyon göstermek için kullanmak için bir protokoldür.
Abstract
Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) böbrekte anjiyogenez ve vasküler geçirgenliği kontrol etmeye yardımcı olur. Diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıkları böbrekte VEGF disregülasyonu ile ilişkilidir. Böbrekte fizyolojik koşullarda VEGF’yi yöneten faktörler iyi anlaşılamamıştır. Luteinizan hormon (LH), bir pro-anjiyojenik hormon, üreme organlarında fizyolojik VEGF ekspresyonunu düzenlemeye yardımcı olur. LH reseptörlerinin böbrekte bulunduğu göz önüne alındığında, biz, Zietchick Araştırma Enstitüsü’nde, lh de böbrek VEGF ifade düzenleyen yardımcı olur burada hipotez. Kanıt sağlamak için, LH düzeylerinin memeli böbreğindeki VEGF düzeylerini tahmin edebildiğini göstermeyi amaçladık. Böbrek içeren çoğu VEGF ile ilgili araştırmalar model olarak alt düzey memeliler (yani, kemirgenler ve tavşan) kullandık. Bu çalışmayı insan vücuduna çevirmek için, vegf ve LH arasındaki ilişkiyi daha yüksek derecede memelilerde (yani büyükbaş ve domuz modelleri) incelemeye karar verildi. Bu protokol böbrek korteksinden gelen toplam protein lizatını kullanır. Bu yöntemin başarısının anahtarları, ölümden hemen sonra mezbaha hayvanlarından böbrek temini ve analit düzeylerinin (böbrek ekstresinde) toplam proteinle normalleştirilmesidir. Bu çalışma, hem büyükbaş hem de domuz böbreklerinde LH ve VEGF arasında anlamlı bir doğrusal ilişki olduğunu başarıyla göstermektedir. Sonuçlar iki farklı türde tekrarlanabilir. Çalışma, ve domuzböbrek özleri kullanımı nın böbrek fizyolojisi çalışmaları için mükemmel, ekonomik ve bol bir kaynak olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır, özellikle VEGF ve diğer analitler arasındaki korelasyonun incelenmesi için.
Introduction
Vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), böbrek ve diğer organlarda anjiyogenez ve vasküler geçirgenliğin düzenlenmesine yardımcı olur1,2 (bundan sonra, VEGF-A VEGF olarak anılacaktır). Böbrekteki VEGF düzeyleri sıkı homeostatik kontrol altındadır. Böbrek VEGF düzeyleri yükseldiğinde veya depresif olduğunda böbrek arızalanabilir. Örneğin, doğumdan sonraki 3 hafta içinde VEGF için podosite özgü heterozigozluk olan farelerde endotelve kansız glomerül (yani insan preeklampsinde görülen böbrek lezyonları) gelişir ve bu heterozigotlarda 3 aylıkken son dönem böbrek yetmezliği görülür. Podosite özgü homozigot nakavtlar doğumdan sonraki 1 gün içinde hidrops ve böbrek yetmezliğinden ölür3,4.
Öte yandan renal VEGF’nin aşırı ekspresyonu proteinüri ve glomerüler hipertrofiye neden olur3,4. Örneğin, VEGF’yi aşırı eksprese eden transgenik tavşanlar nefropatinin erken evrelerinde artmış glomerüler filtrasyon oranları ile progresif proteinüri sergilerler, bunu daha sonrakievrelerdeazalmış glomerüler filtrasyon oranları 3 . Diyabetik erişkinlerde son dönem böbrek hastalığının önemli bir nedeni olan diyabetik nefropati, VEGF disregülasyonu ile güçlü bir şekilde ilişkilidir2,5. Patolojik koşullar altında VEGF ekspresyonunun indüklemesinde hipoksinin rolüne büyük önem verilmiştir5. Ancak, fizyolojik koşullar altında VEGF yöneten faktörler (böbrek ve diğer organlarda hem de) iyi anlaşılmış değildir2,6. Fizyolojik ve patolojik VEGF regülasyonunda rol oynayan bu faktörlerin (oksijen hariç) belirlenmesi önemli bir girişimdir.
Luteinizan hormon (LH), bir pro-anjiyojenik hormon, yumurtalık vetestis7 gibi üreme organlarında fizyolojik VEGF ekspresyonu düzenleyen yardımcı olur 7,8. Önceki çalışmalar da LH olmayan üreme organları, gözler6,9,10 gibi VEGF düzenleyen yardımcı olduğunu kanıtsağlamıştır. LH reseptörleri medulla ve böbrek korteksinde bulunur11,12. Not, böbrek tübüler epitel hücreleri, yanı sıra LH reseptörü, ekspres VEGF11,12,13,14. Birlikte bu iki gözlem alarak, biz LH da böbrek13,14VEGF ekspresyonunun düzenlenmesine yardımcı olduğunu varsaölçekli . Bu LH/VEGF ilişkisine dair kanıt sağlamak için sunulan protokol, LH düzeylerinin böbrekteki VEGF düzeylerini tahmin edebildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. Böbrek içeren birçok önceki VEGF ile ilgili araştırmalar düşük sıramemeli modelleri (yani, kemirgenler ve tavşan)2kullandık. Bu çalışmayı insan vücuduna çevirmek için, çalışma vegf ve LH arasındaki ilişkiyi üst düzey memelilerde (burada, büyükbaş ve domuz modelleri) inceler. Bu amaca ulaşmak için büyükbaş ve domuz böbreklerinin korteks bölgesinden total protein lizatı hazırlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan ölümünden hemen sonra mezbahadan böbrek temini bu metodolojide başarının anahtarıdır. Bu insan kadavralar yerine ve domuz organları kullanarak ana avantajıdır. Genellikle insan kadavra organları temin kadar ölüm saatinden en az 12-24 saat gecikme vardır. Vücut organlarının kimyasal bileşimi önemli ölçüde 2 saat post-mortem içinde değişir çünkü15,16, Insan kadavra böbreklerde VEGF-çalışmalar gerçek yaşam koşulları yans?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar sığır ve domuz böbrekleri sağlamak için Scholl Mezbaha (Blissfield, MI) teşekkür ederiz. Bu çalışma için hibe fonu kullanılmadı.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neurosciences. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
