लार्वास्पा, लंबी अवधि के समय-चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते ड्रोसोफिला लारवा के लिए एक विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल बढ़ते ड्रोसोफिला लार्वा के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि बरकरार जीवित जानवरों में 10 घंटे से अधिक समय तक निर्बाध समय-चूक इमेजिंग प्राप्त की जा सके। इस विधि का उपयोग लार्वा शरीर की दीवार के करीब कई जैविक प्रक्रियाओं को छवि देने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
लाइव इमेजिंग सेल जीव विज्ञान के सवालों की जांच के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । ड्रोसोफिला लार्वा विशेष रूप से वीवो लाइव इमेजिंग में उपयुक्त है क्योंकि लार्वा शरीर की दीवार और अधिकांश आंतरिक अंग पारदर्शी हैं। हालांकि, 30 से अधिक समय तक बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर लाइव इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है क्योंकि लंबे समय तक लार्वा को स्थिर करना मुश्किल है। यहां हम लारवास्पा नामक लार्वा बढ़ते विधि पेश करते हैं जो 10 घंटे से अधिक समय तक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ लाइव ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इस विधि में यूवी-प्रतिक्रियाशील गोंद का उपयोग करके कवरस्लिप में लार्वा को आंशिक रूप से संलग्न करना और इसके अतिरिक्त पॉलीडिमिथाइलसिलिऑक्सेन (पीडीएम) ब्लॉक का उपयोग करके लार्वा आंदोलन को रोकना शामिल है। यह विधि दूसरे इंस्टार से तीसरे इंस्टार को भटकने के लिए विकासात्मक चरणों में लार्वा के साथ संगत है। हम ड्रोसोफिला सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स की गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में इस विधि के अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें डेंराइट विकास और चोट-प्रेरित डेन्डराइट डिजनरेशन शामिल हैं। इस विधि को लार्वा शरीर की दीवार के पास होने वाली कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
समय-चूक लाइव इमेजिंग गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। समय चूक फिल्मों द्वारा प्रदान की स्थानिक और लौकिक जानकारी सेल जीव विज्ञान के सवालों के जवाब देने के लिए महत्वपूर्ण विवरण प्रकट कर सकते हैं । ड्रोसोफिला लार्वा लाइव इमेजिंग का उपयोग करके जांच के लिए वीवो मॉडल में एक लोकप्रिय रहा है क्योंकि इसकी पारदर्शी शरीर की दीवार आंतरिक संरचनाओं की नॉनइनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देती है1,2। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में कई आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं जो शारीरिक संरचनाओं और मैक्रोमॉलिक्यूल्स3को फ्लोरोसेंटी लेबल करने के लिए हैं। हालांकि, ड्रोसोफिला लार्वा की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है। स्थिर प्रारंभिक भ्रूण या पिल्ले के विपरीत, ड्रोसोफिला लार्वा लगातार चलते हैं, लाइव इमेजिंग के लिए स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है। लाइव ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर करने के प्रभावी तरीकों में क्लोरोफॉर्म4के साथ हेलोकार्बन तेल में बढ़ते हुए, आइसोफ्लोरान या डिक्लोरवोस सॉल्यूशन5का उपयोग करके एनेस्थेटाइजिंग और कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड6के बीच संकुचित होना शामिल है। हालांकि इनमें से कुछ तरीकों का उपयोग माइक्रोस्कोपी के लिए किया गया है, लेकिन उनमें से कोई भी दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए प्रभावी नहीं है। इमेजिंग बॉडी वॉल न्यूरॉन्स के लिए पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी7,8,9का उपयोग करके लार्वा रेंगने के लिए अन्य तरीके विकसित किए गए थे । हालांकि, लार्वा के आंदोलन के कारण सेलुलर गतिशीलता की निगरानी के लिए ये विधियां आदर्श नहीं हैं।
ड्रोसोफिला लार्वा की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग प्राप्त करने के लिए नए तरीके विकसित किए गए हैं। पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएम) “लार्वा चिप” का उपयोग करके, ड्रोसोफिला लार्वा को एनेस्थेटाइजेशन के बिना एक विशेष माइक्रोचैंबर में वैक्यूम-जनित सक्शन के माध्यम से प्रभावी ढंग से स्थिर किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उच्च लौकिक संकल्प प्रदान नहीं करती है और इसकी पशु आकार10पर सख्त सीमाएं हैं। एनेस्थेटाइजेशन डिवाइस का उपयोग करने वाली एक अन्य विधि ने कई समय बिंदुओं पर ड्रोसोफिला लार्वा की लाइव इमेजिंग हासिल की और इसे न्यूरोमस्कुलरजंक्शनों 11, 12,13,14,15,16का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि, यह विधि 30 से अधिक समय तक निरंतर इमेजिंग की अनुमति नहीं देती है और बार-बार डिफ्लूरन का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो तंत्रिका गतिविधि को बाधित कर सकती है और17,18अध्ययन की गई जैविक प्रक्रिया को प्रभावित कर सकती है। हाल ही में, माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस और क्रायोएनेस्थीसिया को जोड़ती एक नई विधि का उपयोग कम समय (मिनट)19के लिए विभिन्न आकारों के लार्वा को स्थिर करने के लिए किया गया है। हालांकि, इस विधि के लिए विशेष उपकरणों जैसे कूलिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है और स्थिरीकरण की लंबी अवधि के लिए लार्वा के बार-बार ठंडा होने की आवश्यकता होती है।
यहां हम ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर करने की एक बहुमुखी विधि पेश करते हैं जो 10 घंटे से अधिक समय तक निर्बाध समय-चूक इमेजिंग के साथ संगत है। इस विधि, जिसे हम “आंशिक लगाव द्वारा लार्वा स्थिरीकरण” (लार्वास्पा) कहते हैं, में कस्टम-निर्मित इमेजिंग कक्ष में इमेजिंग के लिए एक कवरस्लिप में लार्वा छल्ली का पालन करना शामिल है। यह प्रोटोकॉल इमेजिंग चैंबर बनाने के तरीके और विभिन्न प्रकार के विकास चरणों में लार्वा को कैसे माउंट करना है, इसका वर्णन करता है। लारवास्पा विधि में, वांछित शरीर खंडों को यूवी-प्रतिक्रियाशील गोंद का उपयोग करके कवरस्लिप से चिपका दिया जाता है। एक पीडीएम क्यूबॉइड अतिरिक्त रूप से लार्वा पर दबाव लागू करता है, जिससे बचने को रोका जा सकता है। इमेजिंग चैंबर में हवा और नमी इमेजिंग के दौरान आंशिक रूप से स्थिर लार्वा के अस्तित्व को सुनिश्चित करती है। अन्य तकनीकों पर लार्वास्पा के फायदों में निम्नलिखित शामिल हैं: (1) यह पहली विधि है जो उच्च लौकिक और स्थानिक समाधान के साथ घंटों तक बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देती है; (2) विधि लार्वा आकार पर कम सीमाएं हैं; (3) इमेजिंग चैंबर और पीडीएम क्यूबॉइड का निर्माण न्यूनतम लागत पर किया जा सकता है और पुन: उपयोग करने योग्य हैं।
लार्वा बढ़ते विधि का वर्णन करने के अलावा, हम ड्रोसोफिला डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन (दा) न्यूरॉन्स के डेंराइट विकास और डेंराइट डिजनरेशन का अध्ययन करने के लिए इसके आवेदन के कई उदाहरण प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम लार्वास्पा का वर्णन करते हैं, जो दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए लाइव ड्रोसोफिला लार्वा को बढ़ाते हुए एक बहुमुखी विधि है। इस विधि को लार्वा को ठीक करने या फिर से बढ़ाने की आवश्यकता नहीं है,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लारवास्पा विधि के एक पुराने संस्करण की स्थापना के लिए लिंगफेंग तांग का शुक्रिया अदा करते हैं; इमेजिंग चैंबर के पहले प्रोटोटाइप बनाने के लिए कॉर्नेल ओलिन हॉल मशीन की दुकान पर ग्लेन हंस; धातु के फ्रेम के निर्माण और पीडीएफक्यूब्स बनाने पर सुझाव प्रदान करने के लिए फिलिप इसरमैन; माइक्रोस्कोप तक पहुंच के लिए कॉर्नेल बीआरसी इमेजिंग सुविधा (एनआईएच ग्रांट S10OD018516 द्वारा वित्त पोषित); पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मारिया सापड़। इस काम को एचजे को सम्मानित एक कॉर्नेल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; एक कॉर्नेल स्टार्ट-अप फंड और एनआईएच अनुदान (R01NS099125 और R21OD023824) सीएच एचजे और सीएच को प्रदान की परियोजना की कल्पना की और प्रयोगों को डिजाइन किया । एचजे ने प्रयोग किए । एचजे और सीएच ने पांडुलिपि लिखी ।
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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