Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Résumé

Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.

Résumé

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans l’initiation, le développement et la récurrence des tumeurs après le traitement, et sont devenues le centre d’attention de nombreuses études au cours des dernières décennies. Par conséquent, il est important de développer des méthodes pour étudier le rôle des gènes clés impliqués dans la tige des cellules cancéreuses. Le cancer gastrique (GC) est l’un des types de cancers les plus courants et mortels. Les cellules souches du cancer gastrique (GCSC) sont considérées comme la racine de la rechute du cancer gastrique, des métastases et de la résistance aux médicaments. Comprendre la biologie des CSG est nécessaire pour faire progresser le développement de thérapies ciblées et éventuellement pour réduire la mortalité chez les patients. Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.

Introduction

Le cancer gastrique (GC) est l’un des types les plus communs et mortels de cancers¹. Malgré les progrès de la chirurgie combinée, la chimiothérapie et la radiothérapie dans la thérapie GC, le pronostic reste faible et le taux de survie à cinq ans est encore très faible². La récurrence et la métastase sont les principales raisons qui causent les décès post-traitement.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont un sous-ensemble de cellules cancéreuses qui possèdent la capacité de se renouveler et de générer les différentes lignées cellulaires qui reconstituent la tumeur³....

Protocole

Toutes les expérimentations utilisant des cellules souches cancéreuses gastriques dérivées du patient décrites ici ont été approuvées par le comité éthique local⁷.

1. Culture de cellules souches du cancer gastrique

1. Préparation des GCSCs support de culture complet
   1. Préparer le milieu de culture complet des GCSC en ajoutant un milieu frais DME/F12 avec les ingrédients essentiels suivants : 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insuline/Transferrin/Sélénite de sodium, 0,2% glucose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Acide aminé non essentiel, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 μM thioglycérol, 1....

Résultats

Les cellules souches de cancer gastrique de l’adénocarcinome gastrique humain primaire ont été cultivées dans le milieu de culture sérique-libre. Après 6 jours, les cellules se sont étendues du phénotype unicellulaire (figure 1A)pour former de grandes sphères (figure 1B).

Pour évaluer la fonction de clusterin dans les GCSC, des séquence.......

Discussion

GC est la troisième cause de décès lié au cancer dans le monde. Les CSGC sont essentiels dans la rechute du cancer gastrique, la métastase et la résistance aux médicaments. L’utilisation des GCSE de patients atteints de cancer gastrique nous permettra d’explorer leur point faible et de développer les médicaments de ciblage pour le traitement des patients gc.

L’essai de formation de sphère est une méthode utile pour examiner le potentiel d’auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses in.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 &mu ; m filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycérol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Exempt d’animaux Recombinant humain EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), sans sérum	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess	Invitrogen	C10228
Compteur de cellules automatisé Countess II	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco
Hyclate de doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190250
Sérum fœtal bovin, qualifié, Australie	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplément	Gibco	35050061
Insuline, Transferrin, Solution de sélénium (ITS -G), 100X	Gibco
Vecteur lentiviral	GeneChem	GV307
Concentrateur Lenti-X	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Réactif de transfection	Invitrogen	L3000015
MEM Solution d’acides aminés non essentiels, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0,45 & micro ; m, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Tubes cryogéniques	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cellculture/Boîtes de Pétri	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Sérum réduit Gibco		31985070
Pénicilline-Streptomycine, Gibco		liquide 15140122
pHelper 1.0 (composant gag/pol)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (composant VSVG)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Milieu de cryoconservation	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Solution de dissociation cellulaire	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tampon Tris-HCI, pH 7,5	Invitrogen	15567027
Microscope inversé ZEISS	Axio	Vert.A1

Lames de chambre de comptage cellulaire 10569044 41400045