Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie
Summary
In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.
Abstract
Kanker stamcellen (CSCs) zijn betrokken bij tumor initiatie, ontwikkeling en herhaling na de behandeling, en zijn uitgegroeid tot het centrum van de aandacht van vele studies in de afgelopen decennia. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen om de rol van belangrijke genen die betrokken zijn bij kankercelstamness te onderzoeken. Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker. Maagkanker stamcellen (GCSCs) worden beschouwd als de wortel van maagkanker terugval, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Inzicht in GCS biologie is nodig om de ontwikkeling van gerichte therapieën te bevorderen en uiteindelijk om de mortaliteit bij patiënten te verminderen. In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.
Introduction
Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker1. Ondanks de vooruitgang in gecombineerde chirurgie, chemotherapie en radiotherapie in GC-therapie, blijft de prognose slecht en is de overlevingskans van vijf jaar nog steeds zeer laag2. Recidief en metastase zijn de belangrijkste redenen oorzaak van de sterfgevallen na de behandeling.
Kanker stamcellen (CSCs) zijn een subset van kankercellen die de mogelijkheid om zelf te vernieuwen en het genereren van de verschillende cellijnen die de tumor reconstrueren3bezitten. CsCs worden verondersteld verantwoordelijk te zijn voor kanker terugval en metastase vanwege hun mogelijkheden van zelfvernieuwing en zaaien van nieuwe tumoren, evenals hun weerstand tegen traditionele chemo- en radiotherapieën4. Daarom bieden het richten van CCS en eliminatie van CSC’s een spannend potentieel om de behandeling te verbeteren en de mortaliteit van kankerpatiënten te verminderen.
CsCs zijn geïsoleerd van vele soorten vaste tumoren5. In 2009 werden maagkankerstamcellen (GCSCs) geïsoleerd van menselijke maagkankercellijnen oorspronkelijk beschreven door Takaishi et al.6. Chen en collega’s identificeerden en gezuiverd ANGCS’s uit menselijke maag-adenocarcinoom (GAC) tumorweefsels7. Deze bevindingen bieden niet alleen de mogelijkheid om de biologie van CSCs te bestuderen, maar bieden ook een groot klinisch belang.
Een bijzonder kenmerk van csc’s is hun vermogen om een bol8te vormen . Enkele cellen zijn verguld in niet-loodbare omstandigheden bij een lage dichtheid, en alleen de cellen bezeten met zelfvernieuwing kan uitgroeien tot een solide, bolvormige cluster genaamd een bol. Zo is de bolvorming test is beschouwd als de gouden standaard test en op grote schaal gebruikt om stamcel zelfvernieuwing potentieel in vitro te evalueren.
RNA interferentie (RNAi) is een krachtig onderzoeksinstrument om de genfunctie te bestuderen door de knockdown van een specifiek gen9. Echter, lange termijn stabiele gen knockdown technologieën hebben bepaalde beperkingen, zoals de uitdaging van het verkennen van de functie van een gen dat essentieel is voor de overleving van cellen. Voorwaardelijke RNAi-systemen kunnen nuttig zijn voor de downregulatie van gewenste genen op een temporele en/of speciale gecontroleerde manier door de toediening van een inducerende agent. De tetracycline (Tet)-inducible systemen zijn een van de meest gebruikte voorwaardelijke RNAi systemen10. De Tet-inducible systemen kunnen leiden tot doelgenuitschakeling door het beheersen van de expressie van shRNA op toevoeging van een exogene aansporing (bij voorkeur doxycycline, Dox). De Tet-inducible systemen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten: Tet-On of Tet-Off systemen. De expressie van shRNA kan worden ingeschakeld (Tet-On) of uitgeschakeld (Tet-Off) in aanwezigheid van de inducer. In het Tet-ON-systeem zonder aansporing, bindt de constitutief uitgedrukte Tet-onderdrukker (TetR) zich aan de Tet-responsieve element (TRE) sequentie met een Tet-responsieve Pol III-afhankelijke promotor voor shRNA-expressie, waardoor de expressie van de shRNA wordt onderdrukt. Terwijl op toevoeging van Dox, is de TetR afgezonderd uit de buurt van de Tet-responsieve Pol III-afhankelijke promotor. Dit vergemakkelijkt de expressie van de shRNA en leidt tot gen knockdown.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een functioneel tetracycline-induceerbaar shRNA-systeem en een aangepaste bolvormingstest om de functie van clusterin in door patiënten afgeleide GCSCs11te bestuderen. We gebruiken het beschreven protocol om de effecten van clusterin in CSCs zelfvernieuwing te bestuderen. Deze methode is ook van toepassing op andere soorten kankercellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC is wereldwijd de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. GCSCs zijn van cruciaal belang bij terugval van maagkanker, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Met behulp van GCSCs van maagkanker patiënten zal ons toelaten om hun zwakke plek te verkennen en de targeting drugs te ontwikkelen voor de behandeling van GC patiënten.
De bolvorming test is een nuttige methode om kanker stamcel zelfvernieuwing potentieel in vitro te onderzoeken. Resultaten kunnen wor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nature Science Foundation van de provincie Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong (A2019405), de National Natural Science Foundation of China (81772957), de Technologieprogramma van de provincie Guangdong in China (2017B030301016) en de Industry and Information Technology Foundation van Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
