Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells
Summary
In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) sind in tumorinititoriöse, Entwicklung und Rezidiv nach der Behandlung involviert und sind in den letzten Jahrzehnten zum Mittelpunkt vieler Studien geworden. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um die Rolle der Schlüsselgene zu untersuchen, die an der Vorstämmung von Krebszellen beteiligt sind. Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten. Magenkrebs-Stammzellen (GCSCs) gelten als die Wurzel von Magenkrebsrückfall, Metastasierung und Medikamentenresistenz. Das Verständnis der GCSCs-Biologie ist notwendig, um die Entwicklung zielgerichteter Therapien voranzutreiben und schließlich die Sterblichkeit bei Patienten zu senken. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.
Introduction
Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten1. Trotz Fortschritten in der kombinierten Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie in der GC-Therapie, Prognose bleibt schlecht und die Fünf-Jahres-Überlebensrate ist immer noch sehr niedrig2. Rezidivundundundundien sind die Hauptgründe für die Todesfälle nach der Behandlung.
Krebsstammzellen (CSCs) sind eine Teilmenge von Krebszellen, die die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu erneuern und die verschiedenen Zelllinien zu erzeugen, die den Tumor rekonstituieren3. CSCs werden geglaubt, um für KrebsRückfall und Metastasierung verantwortlich zu sein, wegen ihrer Fähigkeiten der Selbsterneuerung und Aussaat neuer Tumoren, sowie ihre Resistenz gegen traditionelle Chemo- und Radiotherapien4. Daher bieten die ausrichtung auf CSCs und die Eliminierung von CSCs ein spannendes Potenzial, um die Behandlung zu verbessern und die Sterblichkeit von Krebspatienten zu senken.
CSCs wurden von vielen Arten von soliden Tumoren isoliert5. Im Jahr 2009 wurden Magenkrebsstammzellen (GCSCs), die aus menschlichen Magenkrebszelllinien isoliert wurden, ursprünglich von Takaishi et al.6beschrieben. Chen und Kollegen identifizierten und reinigten zunächst GCSCs aus tumorgeweben des menschlichen Magenadenokarzinoms (GAC)7. Diese Ergebnisse bieten nicht nur die Möglichkeit, GCSCs Biologie zu studieren, sondern bieten auch eine große klinische Bedeutung.
Ein besonderes Merkmal der CSCs ist ihre Fähigkeit, eine Kugel8zu bilden. Einzelne Zellen werden unter nicht haftenden Bedingungen bei geringer Dichte plattiert, und nur die Zellen, die mit Selbsterneuerung besessen sind, können zu einem festen, kugelförmigen Cluster, einer Kugel, der Kugel genannt wird, heranwachsen. So wurde der Kugelbildungstest als Goldstandard-Assay betrachtet und weit verbreitet eingesetzt, um das Potenzial der Stammzellselbsterneuerung in vitro zu bewerten.
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug, um die Genfunktion durch den Knockdown eines bestimmten Gens zu untersuchen9. Langfristige stabile Gen-Knockdown-Technologien haben jedoch gewisse Einschränkungen, wie die Herausforderung, die Funktion eines Gens zu erforschen, das für das Überleben der Zelle unerlässlich ist. Bedingte RNAi-Systeme können für die Abregulierung der gewünschten Gene in zeitlicher und/oder speziell kontrollierter Weise durch die Verabreichung eines induzierenden Mittels nützlich sein. Die Tetracyclin (Tet)-induzierbaren Systeme sind eines der am häufigsten verwendeten bedingten RNAi-Systeme10. Die Tet-induzierbaren Systeme können Zielgen-Silencing induzieren, indem sie die Expression von shRNA nach Zugabe eines exogenen Induktors (vorzugsweise Doxycyclin, Dox) steuern. Die Tet-induzierbaren Systeme lassen sich in zwei Typen unterteilen: Tet-On- oder Tet-Off-Systeme. Die Expression von shRNA kann in Gegenwart des Induktors aktiviert (Tet-On) oder ausgeschaltet werden (Tet-Off). Im Tet-ON-System ohne Induktor bindet der konstitutiv exprimiv exprimiv exprimierte Tet-Repressor (TetR) an die Tet-responsive Element (TRE)-Sequenz, die einen Tet-responsivepolischen Pol III-abhängigen Promotor für die shRNA-Expression enthält, wodurch die Expression der shRNA unterdrückt wird. Während die TetR nach Zugabe von Dox vom Tet-responsivepol III-abhängigen Promoter entfernt wird. Dies erleichtert die Expression der shRNA und führt zu einem Genknockdown.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein funktionelles Tetracyclin-induzierbares shRNA-System und einen angepassten Kugelbildungstest, um die Funktion von Clusterin in patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Clusterin wurde in einer früheren Studie11als neuartiges Schlüsselmolekül zur Aufrechterhaltung der Stammheit und des Überlebens von GCSCs identifiziert. Wir verwenden das beschriebene Protokoll, um die Auswirkungen von Clusterin bei der Selbsterneuerung von GCSCs zu untersuchen. Diese Methode gilt auch für andere Arten von Krebsstammzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC ist die dritthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. GCSCs sind entscheidend bei Magenkrebsrückfällen, Metastasen und Medikamentenresistenzen. Mit GCSCs von Magenkrebspatienten können wir ihre Schwachstelle erforschen und die Targeting-Medikamente zur Behandlung von GC-Patienten entwickeln.
Der Sphärenbildungstest ist eine nützliche Methode, um das Selbsterneuerungspotenzial von Krebsstammzellen in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der geb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Nature Science Foundation der Provinz Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), die Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province (A2019405), die National Natural Science Foundation of China (81772957), das Science and Technology Program der Provinz Guangdong in China (2017B030301016) und die Industry and Information Technology Foundation of Shenzhen (201803091000135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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