患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた
Summary
本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。
Abstract
がん幹細胞(CSC)は、治療後の腫瘍の開始、発達および再発に関与し、過去数十年の間に多くの研究の注目を集めています。したがって、がん細胞幹細胞に関与する重要な遺伝子の役割を調べる方法を開発することが重要です。胃癌(GC)は、最も一般的で致命的なタイプの癌の1つです。胃癌幹細胞(GCSC)は、胃癌再発、転移および薬剤耐性の根源であると考えられている。GCSCs生物学を理解することは、標的療法の開発を進め、最終的には患者の死亡率を減らすために必要である。本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。
Introduction
胃癌(GC)は、癌の最も一般的かつ致命的なタイプの1である。GC療法における併用手術、化学療法および放射線療法の進歩にもかかわらず、予後は依然として悪く、5年生存率は依然として非常に低い2である。再発と転移は、治療後の死亡を引き起こす主な理由です。
癌幹細胞(CSC)は、腫瘍3を再構成する異なる細胞系統を自己更新し、生成する能力を有する癌細胞のサブセットである。CSCは、自己再生および新しい腫瘍の播種の能力と、伝統的な化学および放射線療法4に対する耐性のために、癌の再発および転移の原因であると考えられている。したがって、CSCを標的とし、CSCを排除することは、治療を改善し、癌患者の死亡率を減らすエキサイティングな可能性を提供する。
CSCは、多くのタイプの固形腫瘍5から単離されている。2009年には、ヒト胃癌細胞株から分離された胃癌幹細胞(GCSC)が、もともと高石ららによって記述された。Chenたちの研究グループは、まずヒト胃腺癌(GAC)腫瘍組織からGCSCを同定し、精製した7.これらの知見は、GCSCs生物学を研究する機会を提供するだけでなく、臨床的に非常に重要な役割を提供する。
CSCの特長は球体8を形成する能力です。単一細胞は低密度で非接着条件でメッキされ、自己再生を有する細胞のみが球体と呼ばれる固体球状のクラスターに成長することができる。このように、球形成アッセイは、金標準アッセイと見なされ、インビトロで幹細胞の自己再生電位を評価するために広く使用されている。
RNA干渉(RNAi)は、特定の遺伝子9のノックダウンによる遺伝子機能を研究するための強力な研究ツールです。しかし、長期安定遺伝子ノックダウン技術には、細胞の生存に不可欠な遺伝子の機能を探求するという課題など、一定の制限があります。条件付きRNAiシステムは、誘導剤の投与によって時間的および/または特別に制御された方法で所望の遺伝子のダウンレギュレーションに有用であり得る。テトラサイクリン(Tet)誘導性システムは、最も広く使用されている条件付きRNAiシステム10の1つである。Tet誘導可能なシステムは、外因性誘導体(優先的にドキシサイクリン、ドキックス)の添加時にshRNAの発現を制御することによって標的遺伝子サイレンシングを誘導することができる。Tet-誘導可能なシステムは、テトオンシステムとテトオフシステムの2種類に分けられます。shRNAの発現は、インデューサーの存在下でオン(Tet-On)またはオフ(Tet-Off)することができる。インデューサーを含まないTet-ON系では、構成的に発現したTetリプレッサー(TetR)は、shRNA発現に対するテト応答性ポルIII依存性プロモーターを含むTet応答性要素(TRE)配列に結合し、shRNAの発現を抑制する。Doxの添加時に、TetRはテト応答性ポルIII依存プロモーターから隔離される。これはshRNAの発現を促進し、遺伝子ノックダウンにつながる。
ここで説明するプロトコルは、機能的テトラサイクリン誘導性shRNAシステムと適応球形成アッセイを用いて患者由来のGCSCにおけるクラスタリングインの機能を研究する。11我々は、GCSC自己再生におけるクラスタリングインの効果を研究するために、上記のプロトコルを使用する。この方法論は、他のタイプの癌幹細胞にも適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
GCは、世界で癌関連死の第3位の原因です。GCSCは胃癌の再発、転移および薬剤耐性において重大である。胃癌患者のGCSCを使用することで、弱点を探索し、GC患者の治療のための標的薬を開発することができます。
球形成アッセイは、がん幹細胞の自己再生ポテンシャルをインビトロで調べるのに有用な方法である。結果は、形成された球の割合を、シードされた単一細胞?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は広東省自然科学財団(2018A030310586、 2020A1515010989),広東省医学科学研究財団(A2019405)、中国国立自然科学財団(81772957)、科学と科学と 中国広東省の技術プログラム(2017B030301016)、深セン産業情報技術財団(20180309135860)。
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
