Kombinerad villkorlig Knockdown och anpassad sfärbildning assay att studera en Stemness-Associated Gene av patient-derived Gastric Cancer Stamceller
Summary
I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med hjälp av en villkorlig knockdown system och en anpassad sfär bilda analys att studera effekten av clusterin på stemness av patient-härledda GCSCs. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera både in vitro- och in vivo-funktion hos stemness-associerade gener i olika typer av CSC.
Abstract
Cancer stamceller (CSCs) är inblandade i tumör initiering, utveckling och återkommande efter behandling, och har blivit i centrum för uppmärksamheten i många studier under de senaste decennierna. Därför är det viktigt att utveckla metoder för att undersöka vilken roll viktiga gener som är involverade i cancercellstamhet. Magsäckscancer (GC) är en av de vanligaste och dödliga typerna av cancer. Gastric cancer stamceller (GCS) tros vara roten till magcancer återfall, metastasering och läkemedelsresistens. Förstå GCSCs biologi behövs för att främja utvecklingen av riktade terapier och så småningom för att minska dödligheten bland patienter. I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med hjälp av en villkorlig knockdown system och en anpassad sfär bilda analys att studera effekten av clusterin på stemness av patient-härledda GCSCs. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera både in vitro- och in vivo-funktion hos stemness-associerade gener i olika typer av CSC.
Introduction
Magsäckscancer (GC) är en av de vanligaste och dödligaste typerna av cancer1. Trots framsteg inom kombinerad kirurgi, kemoterapi och strålbehandling i GC terapi, prognosen är fortfarande dålig och den femåriga överlevnaden är fortfarande mycket låg2. Återkommande och metastasering är de främsta orsakerna orsaka de efter behandling dödsfall.
Cancer stamceller (CSCs) är en delmängd av cancerceller som har förmågan att själv förnya och generera de olika cell härstamningar som rekonstrueratumören 3. CSCs tros vara ansvarig för cancer återfall och metastasering på grund av deras förmåga att självförnyelse och sådd nya tumörer, liksom deras motståndskraft mot traditionella cellgifter- och radioterapier4. Därför, inriktning CSCs och eliminering av CSCs ger en spännande potential att förbättra behandlingen och minska dödligheten hos cancerpatienter.
CSCs har isolerats från många typer av solida tumörer5. Under 2009, magcancer stamceller (GCS) isolerade från mänskliga magcancer cellinjer beskrevs ursprungligen av Takaishi et al.6. Chen och kollegor först identifierade och renas GCSCs från mänskliga mag adenokarcinom (GAC) tumör vävnader7. Dessa resultat inte bara ger en möjlighet att studera GCSCs biologi men också ge stor klinisk betydelse.
Ett särskilt kännetecken för CSCs är deras kapacitet att bilda en sfär8. Enstaka celler är pläterade i nonadherent förhållanden vid låg densitet, och endast de celler som besatt med självförnyelse kan växa till en solid, sfäriska kluster som kallas en sfär. Således, sfären formation assay har betraktats som den guldmyntfoten analysen och allmänt används för att utvärdera stamceller självförnyelse potential in vitro.
RNA-interferens (RNAi) är ett kraftfullt forskningsverktyg för att studera genfunktionen genom att en specifik gen9slår ned . Men långsiktiga stabila gen knockdown teknik har vissa begränsningar, såsom utmaningen att utforska funktionen av en gen som är avgörande för cellens överlevnad. Villkorliga RNAi-system kan vara användbara för nedreglering av önskade gener på ett tidsmässigt och/eller särskilt kontrollerat sätt genom administrering av ett inducerande medel. De tetracyklin (Tet)-inducible system är en av de mest använda villkorliga RNAi system10. De Tet-inducible systemen kan framkalla målgenen ljuddämpning genom att kontrollera uttrycket av shRNA vid tillsats av en exogen inducerare (företrädesvis doxycyklin, Dox). De Tet-inducerbara systemen kan delas upp i två typer: Tet-On- eller Tet-Off-system. Uttrycket av shRNA kan slås på (Tet-On) eller stängas av (Tet-Off) i närvaro av induceraren. I Tet-ON-systemet utan inducerare binder den constitutively uttryckta Tet repressor (TetR) till Tet-responsive element (TRE) sekvens som innehåller en Tet-lyhörd Pol III-beroende promotor för shRNA-uttryck, vilket förtränger uttrycket av shRNA. Även vid tillägg av Dox, är TetR bindas bort från Tet-lyhörd Pol III-beroende promotorn. Detta underlättar uttrycket av shRNA och leder till gen knockdown.
Det protokoll som beskrivs här använder ett funktionellt tetracyklin-inducerbart shRNA-system och en anpassad sfärbildningsanalys för att studera funktionen av clusterin i patient-derived GCSCs. Clusterin har identifierats som en ny nyckelmolekyl för att upprätthålla STEMCS stemness och överlevnad i en tidigare studie11. Vi använder det beskrivna protokollet för att studera effekterna av clusterin i GCS:er självförnyelse. Denna metod är även tillämplig på andra typer av cancerstamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC är den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. GCSCs är kritiska i magcancer återfall, metastasering och läkemedelsresistens. Använda GCSE från magcancerpatienter kommer att tillåta oss att utforska deras svaga punkt och utveckla inriktning läkemedel för behandling av GC patienter.
Den sfärbildningsanalys är en användbar metod för att undersöka cancerstamcell självförnyelse potential in vitro. Resultat kan presenteras som andelen sfärer som bildas di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Nature Science Foundation i Guangdong-provinsen (2018A030310586, 2020A1515010989), den medicinska vetenskapliga forskningsstiftelsen i Provinsen Guangdong (A2019405), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81772957), vetenskapsstiftelsen och teknikprogram i Guangdong-provinsen i Kina (2017B030301016), och Industry and Information Technology Foundation of Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
