Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma
Summary
Bu protokolde, clusterin’in hasta kaynaklı GCSC’lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Abstract
Kanser kök hücreleri (CSCs) tedavi sonrası tümör inisiyasyonu, gelişme ve nüks karıştığı, ve son yıllarda birçok çalışmaların ilgi odağı haline gelmiştir. Bu nedenle, kanser hücresi köklüğü ile ilgili önemli genlerin rolünü araştırmak için yöntemler geliştirmek önemlidir. Mide kanseri (GC) en yaygın ve ölümlü kanser türlerinden biridir. Mide kanseri kök hücreleri (GCSCs) mide kanseri nüks kök olduğu düşünülmektedir, metastaz ve ilaç direnci. Hedeflenen tedavilerin gelişimini ilerletmek ve sonunda hastalar arasında mortaliteyi azaltmak için GCSCs biyolojisinin anlaşılması gerekmektedir. Bu protokolde, clusterin’in hasta kaynaklı GCSC’lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Mide kanseri (GC) kanserlerin en yaygın ve mortal tiplerinden biridir1. Kombine cerrahi, kemoterapi ve Radyoterapi GC tedavisinde gelişmelere rağmen, prognoz kötü kalır ve beş yıllık sağkalım oranı hala çokdüşük2 . Tedavi sonrası ölümlerin başlıca nedenleri nüks ve metastazdır.
Kanser kök hücreleri (CSCs) kendini yenilemek ve tümör yeniden farklı hücre soyları oluşturmak yeteneğine sahip kanser hücrelerinin bir alt kümesidir3. CSCs kanser nüks ve metastaz nedeniyle kendi kendini yenileme ve tohumlama yeni tümörler kendi yetenekleri nedeniyle sorumlu olduğuna inanılmaktadır, yanı sıra geleneksel kemoterapi onların direnci- ve radyoterapiler4. Bu nedenle, CSCs hedefleme ve CSCs ortadan kaldırılması tedaviyi iyileştirmek ve kanser hastalarının mortalitesini azaltmak için heyecan verici bir potansiyel sağlar.
CSC’ler birçok tipsolid tümörden izole edilmiştir5. 2009 yılında, mide kanseri kök hücreleri (GCSCs) insan mide kanseri hücre hatları izole başlangıçta Takaishi ve ark.6tarafından tanımlanmıştır . Chen ve meslektaşları öncelikle tespit ve insan mide adenokarsinomu (GAC) tümör dokularından GCSCs saflaştırılmış7. Bu bulgular sadece GCSCbiyoloji eğitimi için bir fırsat sağlamakla kalmamış, aynı zamanda büyük klinik önem de sağlamaktadır.
CSC’lerin belirli bir özelliği küre8oluşturma kapasiteleridir. Tek hücreler düşük yoğunlukta nonadherent koşullarda kaplanır ve sadece kendini yenileme ile sahip hücreler bir küre denilen katı, küresel küme haline büyüyebilir. Bu nedenle küre oluşumu tetkik altın standart test olarak kabul edilmiş ve kök hücre kendini yenileme potansiyelini in vitro olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır.
RNA girişim (RNAi) belirli bir gen9nakavt tarafından gen fonksiyonu çalışma için güçlü bir araştırma aracıdır. Ancak, uzun vadeli istikrarlı gen nakavt teknolojileri, hücre hayatta kalmak için gerekli olan bir genin işlevini keşfetmek meydan okuma gibi bazı sınırlamalar var. Koşullu RNAi sistemleri, indükleyici bir ajanın uygulanması ile istenilen genlerin zamansal ve/veya özel kontrollü bir şekilde küçültülmesi için yararlı olabilir. Tetrasiklin (Tet)-indüklenebilir sistemler en yaygın olarak kullanılan koşullu RNAi sistemlerinden biridir10. Tet-inducible sistemleri bir eksojen indükleyici eklenmesi üzerine shRNA ekspresyonu kontrol ederek hedef gen susturma neden olabilir (tercihen doksisiklin, Dox). Tet-indüklenebilir sistemler iki tipe ayrılabilir: Tet-On veya Tet-Off sistemleri. shRNA ifadesi indükleyicinin varlığında (Tet-Açık) veya kapatılabilir (Tet-Off). Bir indükleyici olmadan Tet-ON sisteminde, kurucu olarak ifade edilen Tet bastırıcı (TetR) shRNA ekspresyonu için Tet duyarlı Pol III bağımlı promotör içeren Tet duyarlı eleman (TRE) dizisine bağlanır, böylece shRNA ifadesini bastırır. Dox’un eklenmesiyle, TetR Tet duyarlı Pol III bağımlı organizatöründen uzak bir şekilde tecrit edilir. Bu shRNA ifadesini kolaylaştırır ve gen nakavt yol açar.
Burada açıklanan protokol, hasta kaynaklı GCSC’lerde kümenin işlevini incelemek için fonksiyonel tetrasiklin indüklenebilir shRNA sistemi ve uyarlanmış küre oluşumu testini kullanır. Clusterin, bir önceki çalışmada GCSC’lerin köklüğünü ve sağkalımını korumak için yeni bir anahtar molekül olarak tanımlanmıştır11. Açıklanan protokolü, GCSC’lerde kümenin kendi kendini yenilemedeki etkilerini incelemek için kullanırız. Bu metodoloji kanser kök hücrelerinin diğer türleri için de geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC dünya çapında kansere bağlı ölüm üçüncü önde gelen nedenidir. Mide kanseri nüks, metastaz ve ilaç direncinde GCSC’ler kritik öneme karşıdır. Mide kanseri hastalarınDan GCSC’ler kullanmak zayıf noktalarını keşfetmemizi ve GC hastalarının tedavisi için hedef edici ilaçları geliştirmemizi sağlayacaktır.
Küre oluşumu teşpinin in vitro kanser kök hücre kendini yenileme potansiyelini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Sonuçlar, tohumlanmış tek hücre s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (2018A030310586, 2020A1515010989), Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı (A2019405), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81772957), Bilim ve Çin’deki Guangdong Eyaleti Teknoloji Programı (2017B030301016) ve Shenzhen Endüstri ve Bilgi Teknolojileri Vakfı (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
